Zašto se apsorpcija metilenskog plavog menja sa koncentracijom

Uzmite jednu bocu matičnog rastvora metilenskog plavog i sipajte rastvor u dve čaše. Prvu napunite matičnim rastvorom, a drugu desetostruko razblaženim rastvorom. Druga čaša je bleđa, kao što se i očekuje. Pogledajte pažljivo i videćete da se još nešto promenilo. Nijansa je drugačija. Jedan rastvor naginje čistoj nebeskoplavoj boji, a drugi plavoj sa ljubičastim tonom. Razblaživanje nije samo smanjilo intenzitet. Promenilo je koja hemijska vrsta najviše doprinosi apsorpciji.

Objašnjenje ove promene je jednostavno. Rastvoreno metilensko plavo nije samo jedna hemijska vrsta. Pojedinačni katjon boje, nazvan monomer, može se složiti licem uz lice sa drugim katjonom i formirati dimer, a dimeri mogu prerasti u veće agregate. Svaki oblik ima sopstveni apsorpcioni spektar. Ono što spektrofotometar prikazuje jeste zbir doprinosa smeše prisutne u toj kiveti, pod tim uslovima. Promenite sastav smeše i spektar se menja, čak i kada ukupna količina boje prati jednostavan odnos razblaživanja.

Monomer i dimer različito apsorbuju

Zamislite monomer kao ravnu kartu sa pozitivnim naelektrisanjem raspoređenim po njenom sistemu prstenova. Dve takve karte mogu ležati licem uz lice. Pozitivna naelektrisanja se odbijaju, ali ravne aromatične površine privlače se interakcijama slaganja, dok okolna voda i kontra-joni zaklanjaju odbojno delovanje. Rezultat je vezani par sa zajedničkim elektronskim stanjima. Njegovi dozvoljeni prelazi nalaze se na višoj energiji od prelaza monomera, pa se traka dimera pojavljuje na kraćoj talasnoj dužini od trake monomera, dok veći agregati dodatno doprinose plavom delu spektra u vidu ramena.

Pri veoma niskoj koncentraciji u čistoj vodi dominiraju monomeri, a dominantna je traka na većoj talasnoj dužini. Kako ukupna koncentracija raste, udeo uparenog oblika se povećava, a traka na kraćoj talasnoj dužini raste u odnosu na prvu. Odnos dve trake zato pokazuje sastav smeše, a ne neposredno ukupnu koncentraciju. Očitavanje na jednoj talasnoj dužini ne može razdvojiti njihova dva doprinosa bez pretpostavke o tome koji je oblik prisutan.

Zato referentni spektri uvek moraju biti navedeni zajedno sa uslovima. Spektralni referentni podaci za metilensko plavo tabelarno prikazuju položaje traka zajedno sa rastvaračem, pozadinskim sadržajem soli, pH, temperaturom i opsegom koncentracija pri kojima su dobijeni. Ako navedete maksimum bez tih uslova, broj nije dovoljno određen. Dve laboratorije mogu obe biti u pravu kada navode različite spektre iste boje, jer su merile različite smeše.

Šta pomera ravnotežu

Koncentracija je glavni faktor. Da bi nastao dimer, dva monomera moraju da se susretnu, pa njegov udeo raste brže od linearnog porasta ukupne koncentracije boje. Prijavljene konstante dimerizacije u vodi blizu sobne temperature reda su nekoliko hiljada po molaru, pa udeo dimera naglo raste kroz mikromolarni opseg. Široko globalno uklapanje podataka, koje obuhvata koncentracije boje od mikromolarnih do milimolarnih, pokazalo je doprinos tetramera različit od nule već ispod 34 mikromolara. To upozorava da se pri desetinama mikromolara ne treba oslanjati na model sa strogo dve hemijske vrste. Tačni udeli zavise od sredine, zbog čega ovaj članak navodi smerove promena, a ne univerzalnu tabelu za preračunavanje.

So je drugi faktor. Rastvoreni joni zaklanjaju odbojno delovanje između dva katjona, pa dodatak natrijum-hlorida i sličnih elektrolita pomera smešu ka dimerima i agregatima pri istoj koncentraciji boje. Ovaj efekat je vidljiv u istraživanjima agregacije metilenskog plavog u slanim i vodenim sredinama, u kojima je boja u koncentracijama od približno 1 mikromolara do 3.4 milimolara merena pri koncentracijama natrijum-hlorida od 0 do 0.15 molara. U tom uklapanju podataka, udeo tetramera dostigao je približno 0.93 pri kombinaciji visoke koncentracije boje i visokog sadržaja soli. Spektar snimljen u vodi i spektar snimljen u fiziološkom rastvoru zato nisu međusobno zamenljivi standardi.

Temperatura deluje u suprotnom smeru. Slaganje oslobađa vezanu vodu, a toplotno kretanje mu se suprotstavlja, pa zagrevanje rastvora obično razdvaja deo dimera nazad u monomere, dok hlađenje pogoduje udruživanju. Entalpija disocijacije dobijena uklapanjem podataka je negativna, približno minus 30 kilodžula po molu u opsegu od 282 do 333 kelvina, što potvrđuje egzotermno udruživanje. Hladan uzorak izmeren odmah nakon vađenja iz frižidera može delovati više agregirano nego isti uzorak izmeren nakon uspostavljanja ravnoteže na sobnoj temperaturi.

Rastvarač određuje osnovno stanje. Voda, sa svojim snažnim hidrofobnim efektom, podstiče slaganje ravnih katjona boje. Alkoholi poput etanola i metanola bolje solvatizuju prstenove i razgrađuju agregate, pa ista koncentracija boje u etanolu pokazuje veći udeo monomera nego u vodi. Aprotični korastvarači deluju slično: u smešama vode i DMSO-a na 293 kelvina, dodatak DMSO-a suzbijao je dimerizaciju, što ukazuje na strukturu vode kao pokretač slaganja. Kod surfaktanata treba voditi računa o oba smera delovanja. Iznad njihove kritične micelarne koncentracije, micele mogu pojedinačno solubilizovati monomere i obnoviti spektar nalik monomernom. Ispod te tačke, surfaktant suprotnog naelektrisanja može umesto toga podstaći slaganje: pri koncentraciji boje od 100 mikromolara, polimerizacija podstaknuta SDS-om dostigla je maksimum blizu 4 milimolara SDS-a, približno na polovini koncentracije pri kojoj nastaju micele, pre preraspodele pri višim koncentracijama surfaktanta. Rad o uticajima rastvarača i organizovanih sredina na spektre metilenskog plavog pokazuje koliko snažno neposredno molekulsko okruženje, a ne samo ukupna koncentracija, određuje uočene trake.

pH je važan uglavnom pri ekstremnim vrednostima. U približno neutralnom opsegu koji se koristi u većini laboratorijskih postupaka, metilensko plavo ostaje u svom uobičajenom plavom katjonskom obliku, a agregacija je glavni uzrok spektralnih promena. Jaka kiselina ili baza, redoks hemija koja stvara bezbojni leuko-oblik ili vezivanje za proteine i čestice uvode dodatna stanja izvan para monomer–dimer. Kada se spektar promeni nakon dodavanja pufera, proverite da li sastav pufera uključuje soli i komponente koje se vezuju za boju pre nego što sve pripišete isključivo pH vrednosti. Referentni pregled hemije i protonacije razmatra ova pitanja identiteta odvojeno od pitanja agregacije obrađenog ovde.

Zašto se prava Ber–Lambertovog zakona zakrivljuje

Prema Ber–Lambertovom zakonu, apsorbanca je jednaka proizvodu apsorptivnosti, koncentracije i dužine optičkog puta. To je zakon zasnovan na brojanju. On pretpostavlja da objekti koji se broje ostaju isti dok se njihov broj menja: jedna apsorbujuća hemijska vrsta, nepromenljiv spektar, bez hemijskih promena sa koncentracijom, monohromatska merna svetlost, bez rasipanja ili ponovnog emitovanja i svetlost koja zaista prolazi navedenim putem.

Agregacija narušava prvu pretpostavku. Formalno, ukupna apsorbanca ostaje zbir doprinosa pojedinačnih hemijskih vrsta: dužina optičkog puta pomnožena apsorptivnošću svake vrste i njenom sopstvenom koncentracijom. Svaka hemijska vrsta poštuje zakon. Smeša ga ne poštuje, jer su koncentracije pojedinačnih vrsta nelinearne funkcije ukupne koncentracije boje. Kalibraciona kriva apsorbance na traci monomera u odnosu na ukupnu koncentraciju boje zato počinje kao prava u granici velikog razblaženja i zakrivljuje se naniže kako koncentracija raste, jer svaki dodatni priraštaj donosi proporcionalno manje monomera. Kriva očitana na traci dimera zakrivljuje se u suprotnom smeru. Istraživanja agregacije prepoznaju upravo ovaj mehanizam kao izvor uočenih odstupanja od Lambert–Berovog zakona. Uklapanje prave kroz zakrivljeni deo i njena ekstrapolacija predstavljaju tipičnu grešku. Prava važi samo unutar opsega i matrice u kojima je određena.

Razblaživanje stvara sličnu zamku. Razblaživanje koncentrovanog matičnog rastvora radi ulaska u merni opseg instrumenta ne čuva odnos hemijskih vrsta. Razblaženi rastvor u kiveti ponovo uspostavlja ravnotežu pomerenu ka monomeru, pa njegov spektar tačno opisuje razblaženi uzorak, ali netačno opisuje matični rastvor. Preračunavanje spektra matičnog rastvora množenjem apsorbanci vraća procenu ukupnog sadržaja samo ako kalibracija već uzima u obzir tu promenu. Ono nikada ne vraća prvobitni oblik traka. Svako ko poredi spektar koncentrata sa razblaženim referentnim rastvorom poredi dve različite smeše.

Dužina optičkog puta je deo rezultata

Apsorbanca se menja srazmerno rastojanju koje svetlost prelazi kroz uzorak. Kiveta od 10 mm daje deset puta veću apsorbancu od kivete od 1 mm sa istim rastvorom. Ta srazmera je tačna samo za isti rastvor, a zbog agregacije ovo ograničenje ima presudan značaj.

U praksi je dužina optičkog puta sredstvo za ostajanje unutar važećeg opsega. Dug put pruža osetljivost za razblažene, pretežno monomerne rastvore. Kratak put zadržava koncentrovani uzorak u mernom opsegu bez velikog razblaživanja koje bi ponovo uspostavilo drugačiju ravnotežu. Istraživanje agregacije iz kojeg potiču navedeni brojevi primenjivalo je upravo to: kivete od 1 centimetra za koncentracije boje od 1.1 do 34 mikromolara i kivete od 0.01 centimetra za koncentracije od 94 mikromolara do 3.4 milimolara. Postolja za mikrovolumenska merenja i čitači mikrotitarskih ploča uvode sopstvenu geometriju, sa kratkim i ponekad promenljivim optičkim putevima, kao i površinama na kojima se katjonska boja može adsorbovati. Navedite dužinu puta uz broj, kao što spektralni referentni podaci navode rastvarač i so. Apsorbanca bez dužine optičkog puta nije rezultat. To je glasina.

Disciplina merenja proizlazi iz samog mehanizma. Pre očitavanja dovedite uzorke u ravnotežu na istoj temperaturi. Koristite isti tip i orijentaciju kivete, odgovarajuće slepe probe sa istim pozadinskim sadržajem soli i pufera i čisto laboratorijsko posuđe, jer se metilensko plavo adsorbuje na staklo i plastiku, a obojena kiveta čuva trag prethodnog koncentrovanog uzorka. Kada je kinetika agregacije važna, očitajte uzorke ubrzo nakon pripreme i napravite svaku kalibracionu krivu u istoj matrici i pri istoj dužini optičkog puta kao za uzorke nepoznate koncentracije. Pri vizuelnim proverama imajte na umu da je oko loš spektrometar. Da li se bojom rastvora može utvrditi čistoća zasebno je pitanje sa negativnim odgovorom, a promene nijanse usled agregacije jedan su od razloga.

Dijagram koji treba držati pored instrumenta

Slika ispod sažima članak u jedan referentni prikaz za laboratorijski sto. Tri rastvora sadrže istu boju, ali se razlikuju po ukupnoj koncentraciji i pozadinskom sadržaju soli. Njihovi shematski spektri pokazuju kako traka monomera na većoj talasnoj dužini gubi udeo u korist trake dimera na kraćoj talasnoj dužini kako se slaganje povećava. Uslovi su navedeni na slici jer se bez njih krive ne mogu ponovo koristiti. Za izmerene položaje traka pod navedenim uslovima koristite spektralne referentne podatke. Za način na koji boja ulazi u ćelije kada je u rastvoru, pogledajte ulazak u ćelije putem redukcije i raspodele između faza. Za način na koji doza svetlosti i geometrija dodatno oblikuju rezultate fotohemijskih merenja, pogledajte izlaganje svetlosti i geometriju merenja.

Pravilo koje treba zapamtiti ima dva dela. Spektar identifikuje smešu prisutnu u kiveti pod navedenim uslovima. Samo kalibracija napravljena pod tim istim uslovima pretvara apsorbancu u ukupnu koncentraciju.