Članak
Metilensko plavo i ćelijska senescencija: šta mere eksperimenti na fibroblastima
Jedno često pogrešno tumačenje izgleda ovako. Rad navodi da je metilensko plavo omogućilo više od 20 dodatnih udvostručavanja populacije fibroblasta u kulturi, pa čitalac zaključuje da ono uklanja senescentne ćelije ili produžava ljudski životni vek u sličnoj meri. Taj zaključak deluje prirodno. Ipak, pogrešan je u dva odvojena koraka.
Osnovni problem je pojmovni, a ne brojčani. Udvostručavanja populacije, markeri senescencije i merenja telomera odgovaraju na različita pitanja. Istraživanja metilenskog plavog na fibroblastima najbolje je tumačiti kao proučavanje odloženog ulaska u senescenciju kod jednog tipa ćelija u laboratorijskoj posudi, uz potporu merenja mitohondrijske funkcije. To se razlikuje od selektivnog uklanjanja već senescentnih ćelija, a oba pojma razlikuju se od starenja organizma. Širi kontekst te razlike deo je objašnjenja kako mitohondrijski transport elektrona oblikuje ćelijsku energetiku i kako treba tumačiti tvrdnje iz istraživanja metilenskog plavog.
Udvostručavanja populacije beleže istoriju, a ne mladost
Većina ključnih rezultata potiče iz eksperimenata na ćelijama IMR90, soju normalnih fibroblasta ljudskih fetalnih pluća sa ograničenim replikativnim kapacitetom. U ranoj studiji metilenskog plavog i replikativnog životnog veka fibroblasta IMR90, kulture su pasažirane prema rasporedu, a kumulativna udvostručavanja populacije beležena su dok kultura nije prestala da se deli. Tretman nanomolarnim koncentracijama, sa 100 nM kao glavnom koncentracijom, omogućio je kulturama da ostvare više od 20 dodatnih udvostručavanja pre zaustavljanja deobe.
Udvostručavanje populacije je obračunska jedinica. Ono beleži koliko se puta populacija približno udvostručila. Ne pokazuje direktno da li je pojedinačna ćelija senescentna, u stanju mirovanja, diferencirana ili mrtva. Kultura može ostvariti više udvostručavanja zato što ćelije duže zadržavaju sposobnost deobe, zato što se manje ćelija rano zaustavlja usled stresa ili zato što uslovi selektuju proliferativnu subpopulaciju. Sam broj ne može da razdvoji te mogućnosti.
Zato se broj udvostručavanja razmatra zajedno sa markerima. Broj pokazuje koliko je dugo trajala proliferacija. Markeri pokazuju u koje su stanje ušle ćelije koje su prestale da se dele ili koje su preživele.
Vodič kroz ishode: šta pokazuje svaki marker
Senescencija u kulturi je fenotip koji se utvrđuje pomoću više nezavisnih merenja. Nijedno pojedinačno bojenje niti protein ne dokazuju je sami po sebi.
Zaustavljanje rasta uz gubitak sinteze DNK. Trajno zaustavljanje proverava se smanjenom ugradnjom BrdU ili EdU, spljoštenom morfologijom i izostankom ponovnog rasta nakon ponovnog zasejavanja. Time se senescentno zaustavljanje razlikuje od privremenog mirovanja.
Beta-galaktozidaza povezana sa senescencijom. Bojenje na SA-beta-gal pokazuje lizozomsku aktivnost pri pH oko 6.0. Senescentni fibroblasti često su pozitivni na ovo bojenje kako se lizozomska masa povećava. Ono nije specifično, pa se tumači zajedno sa proliferacijom i molekularnim markerima.
Signalni putevi p16 i p21. p16 deluje preko CDK4 i CDK6 i signalnog puta RB. p21 se često indukuje preko p53. Povećanje njihovih nivoa potkrepljuje zaustavljanje deobe, ali nijedan od tih proteina nije svojstven isključivo senescenciji.
Sekretorno stanje. Sekretorni fenotip povezan sa senescencijom, odnosno SASP, odnosi se na izmenjeno oslobađanje citokina, hemokina, faktora rasta i proteaza. Analize RNK ili proteina za faktore SASP opisuju kako ćelije šalju signale susednim ćelijama. One ne mere direktno replikativni kapacitet.
Oksidansi i mitohondrijski pokazatelji. Radovi o metilenskom plavom dodaju mitohondrijski nivo analize: količinu i aktivnost kompleksa IV, potrošnju kiseonika, sintezu hema, membransku masu, membranski potencijal, ATP i signale oksidanasa. Ovi pokazatelji opisuju metaboličko stanje koje prati odloženo zaustavljanje deobe. Sami po sebi ne definišu senescenciju, ali proveravaju predloženi mehanizam. Model redoks ciklusa, u kojem NAD(P)H redukuje metilensko plavo, a citohrom c ga ponovo oksiduje, izložen je u istoj studiji na ćelijama IMR90 koja povezuje redoks ciklus sa manjom proizvodnjom oksidanasa. Povezana pitanja doziranja i raspodele obrađena su u okviru farmakologije metilenskog plavog i izloženosti tkiva.
Brzina skraćivanja telomera. Odgovarajuća jedinica je broj izgubljenih baznih parova po udvostručavanju tokom više nedelja, a ne dužina u jednoj vremenskoj tački. Sporije skraćivanje znači manji gubitak dužine po replikaciji. To ne znači produžavanje, a stres može zaustaviti deobu ćelija IMR90 uz malu promenu telomera.
Poređenje tri eksperimentalna pristupa sa fibroblastima
Izvorni prilog za ovu stranicu jeste poređenje u nastavku. Ono u jednom prikazu objedinjuje tip ćelija, izloženost, merenja i ograničenja.
| Studija | Ćelije i izloženost | Šta je mereno | Šta ne može da pokaže |
|---|---|---|---|
| Atamna i sar., FASEB J 2008 | Normalni fibroblasti IMR90, hronična izloženost nanomolarnim koncentracijama metilenskog plavog, 100 nM kao standardni uslov | Kumulativna udvostručavanja, sadržaj kompleksa IV, povećanje potrošnje kiseonika za 37 do 70 procenata, sinteza hema, sprečavanje prevremene senescencije izazvane vodonik-peroksidom ili kadmijumom, enzimi faze 2 u ćelijama HepG2 | Nije ispitivano uklanjanje senescentnih ćelija. Nema ishoda dugovečnosti kod životinja ili ljudi. Replikativni životni vek ovde znači broj udvostručavanja u laboratorijskoj posudi. |
| Atamna i sar., Redox Biology 2015, opisano u nastavku mehanističkog istraživanja AMPK i biogeneze kompleksa IV | Fibroblasti IMR90, uglavnom 100 nM metilenskog plavog, uz AICAR kao hronični aktivator AMPK za poređenje | Vremenski tok odnosa NAD prema NADH, prolazna fosforilacija AMPK, indukcija PGC-1alpha i SURF1, porast aktivnosti kompleksa IV veći od 100 procenata, 28 procenata manje oksidanasa, sporije skraćivanje telomera, oko 18 dodatnih udvostručavanja naspram oko 2 uz AICAR, bez uticaja na ćelijski ciklus | Poređenje sa AICAR razlikuje se po dozi približno 1000 puta, kao i po specifičnosti, pa ispituje obrazac aktivacije, a ne jednaku potentnost. Rezultat za telomere odnosi se na kulture koje se dele tokom više nedelja. |
| Xiong i sar., Aging Cell 2016, predstavljeno u studiji fibroblasta kod progerije o oporavku mitohondrijskih i jedarnih pokazatelja | Primarni fibroblasti kože kod Hutchinson-Gilfordove progerije i odgovarajuće normalne kontrole, uglavnom 100 nM tokom 5 do 12 nedelja | Oblik mitohondrija pomoću fluorescentne i elektronske mikroskopije, pokretljivost snimanjem živih ćelija, superoksid, membranski potencijal, ATP, PGC-1alpha, markeri proliferacije i senescencije, kao i izbočine jedra, lokalizacija progerina, heterohromatin i ekspresija gena | Model prevremenog starenja specifičan za bolest, a ne normalnog starenja. Oporavak morfologije i markera nije uklanjanje senescentnih ćelija. Nema ishoda efikasnosti kod životinja niti kliničkih ishoda. |
| Xue i sar., pregled u Cells 2021, sažet u pregledu metilenskog plavog kao potencijalnog jedinjenja protiv starenja | Sinteza literature o starenju mozga, neurodegeneraciji, koži, zarastanju rana i progeriji | Predstavlja metilensko plavo kao katalitičko jedinjenje koje učestvuje u redoks ciklusu i može da zaobiđe delove transporta kroz komplekse I i III, u kontekstu teorija starenja zasnovanih na slobodnim radikalima | Samo narativna sinteza. Organizuje hipoteze i navodi gde klinički dokazi ostaju neubedljivi. |
Obrazac koji se ponavlja kroz redove važniji je od bilo kog pojedinačnog reda. Niska doza metilenskog plavog više puta se povezuje sa dužim periodom proliferacije, većom aktivnošću kompleksa IV, slabijim signalima oksidanasa i poboljšanom morfologijom. Pristup ostaje longitudinalan: počinje se ćelijama koje se dele, tretman se primenjuje tokom umnožavanja i beleži se koliko dugo deoba traje. Takva postavka može da potkrepi tvrdnju o odlaganju. Bez drugačije postavke ne može da potkrepi tvrdnju o uklanjanju.
Odlaganje senescencije nije uklanjanje senescentnih ćelija
Odlaganje znači da ćelije koje se dele nastavljaju da se dele duže pre nego što se zaustave. Uklanjanje, koje se često naziva senolitičkim efektom, znači da se već senescentne ćelije selektivno ubijaju ili da se njihov broj smanjuje, dok susedne ćelije koje proliferišu preživljavaju.
Literatura o metilenskom plavom i fibroblastima ispituje prvi pristup. Kulture na početku proliferišu, dobijaju tretman tokom uzastopnih pasaža i kasnije dostižu zaustavljanje deobe. Markeri kao što su SA-beta-gal, p16, p21 i faktori SASP zato se pojavljuju kasnije ili na nižim nivoima pri određenoj pasaži. Takav obrazac očekuje se kad god se početak senescencije pomeri. On ne dokazuje da je bilo koja već senescentna ćelija uklonjena.
Tvrdnja o senolitičkom dejstvu zahtevala bi drugačiju postavku: najpre dovesti kulturu u potvrđenu senescenciju, zatim primeniti jedinjenje, a potom pokazati selektivan gubitak tih senescentnih ćelija u odnosu na kontrole koje proliferišu, uz direktna merenja vijabilnosti i smrti ćelija. Sam pad nivoa nekog markera nije dovoljan, jer se ekspresija može promeniti bez gubitka ćelija, a preostale ćelije koje proliferišu mogu prerasti kulturu. Nijedan od četiri navedena izvora ne koristi takvu postavku selektivnog smanjenja broja ćelija za metilensko plavo, pa tačan opis ostaje aktivnost koja odlaže senescenciju ili deluje protiv senescencije in vitro, a ne senolitička aktivnost. Aspekt oksidativnog stresa u ovoj razlici dodatno je objašnjen u tekstu o tome kako ćelije kontrolišu reaktivne vrste kiseonika.
Rezultat o prolaznoj signalizaciji dodatno naglašava ovu razliku. U istraživanju na ćelijama IMR90 iz 2015, metilensko plavo izazvalo je kratkotrajan porast odnosa NAD prema NADH i kratkotrajnu fosforilaciju AMPK, a zatim indukciju PGC-1alpha i SURF1, koji su oba povezani sa biogenezom kompleksa IV. Hronična aktivacija AMPK pomoću AICAR dala je znatno slabije rezultate u pogledu dodatnih udvostručavanja.
Replikativni životni vek nije ljudska dugovečnost
Replikativni životni vek ćelija meri broj udvostručavanja pre zaustavljanja deobe u kontrolisanoj laboratorijskoj posudi, uz nepromenljive uslove kiseonika, hranljive podloge i ritma pasažiranja. Ljudska dugovečnost obuhvata decenije razvoja, imunitet, krvne sudove, niše matičnih ćelija, ponašanje i bolesti. Jedinjenje može produžiti prvo, a da ne utiče na drugo, što je slučaj kod većine jedinjenja.
Fibroblasti kod progerije nose određenu mutaciju LMNA koja proizvodi progerin, uz fragmentisane i manje pokretljive mitohondrije, nizak ATP, nepravilno oblikovana jedra i gubitak heterohromatina. Metilensko plavo u nanomolarnim koncentracijama poboljšalo je mitohondrijske pokazatelje i znatno popravilo jedarne pokazatelje, uključujući oslobađanje progerina iz membrane. To je upečatljiv oporavak na ćelijskom nivou. Ipak, to je i dalje rezultat na fibroblastima, a autori su ispitivanje na životinjama predstavili kao budući rad. Sam model bolesti dodatno je razmotren u tekstu o metilenskom plavom u modelima progerije i prevremenog starenja.
Iz ovoga sledi praktična kontrolna lista za čitanje.
- Proverite da li je tretman započet pre zaustavljanja deobe ili nakon što je ono potvrđeno. Početak pre zaustavljanja potkrepljuje odlaganje. Za uklanjanje su potrebni tretman nakon zaustavljanja i podaci o selektivnoj smrti ćelija.
- Proverite kako se kretala kriva udvostručavanja kontrolne kulture. Bez kumulativnih udvostručavanja, promene markera ostaju bez konteksta.
- Tražite najmanje dve klase markera, na primer oznaku proliferacije uz p16 ili p21 i SA-beta-gal, umesto samo jednog bojenja.
- Proverite kako su prikazani podaci o telomerama. Brzina skraćivanja po udvostručavanju tokom vremena ima značenje. Jedno merenje dužine ga nema.
- Proverite šta je održavano nepromenjenim. Gustina ćelija pri pasažiranju, kiseonik, promene hranljive podloge i sveži naspram odstajalih matičnih rastvora metilenskog plavog menjaju zaustavljanje deobe fibroblasta.
Kada se čita na ovaj način, literatura o fibroblastima daje metilenskom plavom doslednu, ali ograničenu ulogu: redoks-aktivno jedinjenje koje u niskoj dozi odlaže replikativnu senescenciju u kultivisanim ljudskim fibroblastima uz poboljšanje mitohondrijskih pokazatelja, sa najjačim mehanističkim detaljima vezanim za prolaznu energetsku signalizaciju i biogenezu kompleksa IV, ali bez dokaza u ovim radovima o uklanjanju senescentnih ćelija ili produžavanju ljudskog životnog veka.