Alternative metilenskom plavom za mikroskopiju

Za jednostavan bakterijski razmaz, kristal violet može da zameni metilensko plavo kada je cilj da se vidi oblik ćelija. Za žive ćelije, bolja alternativa može biti fazni kontrast bez ikakvog bojenja. Izbor zavisi od posmatranja koje treba da obavite.

Pretpostavimo da dve osobe ispituju istu bakterijsku kulturu. Jedna želi da razlikuje štapićaste od okruglih ćelija. Druga želi da utvrdi da li je tretman usmrtio bakterije. Boja koja prvoj osobi daje jasnu sliku drugoj možda neće dati upotrebljiv odgovor.

Pre nego što izaberete zamenu, dovršite ovu rečenicu: „Treba da posmatram ___ u ___, a ćelije moraju / ne moraju ostati žive.” Ta rečenica definiše zadatak koji boja mora da obavi.

Počnite od uzorka i pitanja

Prvo odlučite da li ćelije moraju ostati žive, a zatim odredite karakteristiku koju treba da posmatrate:

Ćelije moraju ostati žive: za kretanje ili oblik razmotrite fazni kontrast bez bojenja ili DIC; za jedarnu DNK razmotrite Hoechst 33342 uz fluorescenciju; za integritet membrane izaberite validirani test, kao što je SYTO 9 sa propidijum-jodidom.
Ćelije ne moraju ostati žive: za bakterijsku morfologiju razmotrite jednostavno bojenje kristal violetom ili negativno bojenje nigrozinom; za Gramovu reakciju koristite kompletnu metodu bojenja po Gramu; za jedarnu DNK u fiksiranim ćelijama razmotrite DAPI fluorescenciju. Koristite ovu tabelu da uporedite ograničenja svake grane. Ovo su izbori metoda, a ne uputstva za zamenu bočica u postojećem protokolu.

Šta treba da posmatrate	Uzorak i oprema	Moguća alternativa	Glavno ograničenje
Oblik i raspored bakterija	Pripremljen bakterijski razmaz; svetlo polje	Jednostavno bojenje kristal violetom	Prikazuje morfologiju; ne utvrđuje Gramovu reakciju niti vijabilnost.
Obrisi ćelija na tamnoj pozadini	Bakteriološki preparat; svetlo polje	Negativno bojenje nigrozinom	Priprema i formulacija su važne; neobojena ćelija nije nužno živa.
Gramova reakcija	Pripremljen bakterijski razmaz; svetlo polje	Kompletna metoda bojenja po Gramu	Zahteva kompletnu sekvencu reagensa i kontrole.
Kretanje ili promene u živim ćelijama	Kompatibilan vlažni preparat; fazni kontrast ili DIC	Bez bojenja	Zahteva odgovarajuću optiku; kontrast ne identifikuje molekul.
Jedarna DNK	Fiksirane ćelije; fluorescencija	DAPI	Zahteva kompatibilne ekscitacione i emisione filtere.
Jedarna DNK u živim ćelijama	Žive ćelije; fluorescencija	Hoechst 33342	Ulazak u ćeliju ne dokazuje da su uslovi snimanja bezopasni.
Integritet bakterijske membrane	Nefiksirane bakterije; fluorescencija	SYTO 9 sa propidijum-jodidom	Bojenje membrane je indirektna mera vijabilnosti.

Kod jednostavnog razmaza pažljivo zamenite metodu

Kristal violet je praktičan kandidat kada je zadatak jednobojni prikaz bakterijske morfologije. FDA Bacteriological Analytical Manual navodi dve formulacije kristal violeta pogodne za jednostavno bojenje. Koristite dokumentovanu formulaciju i njen način pripreme; sam naziv boje ne određuje radni reagens.

Kristal violet se koristi i u bojenju po Gramu, ali to ne znači da je jednostavno bojenje kristal violetom isto što i bojenje po Gramu. U ASM protokolu za bojenje po Gramu, diferencijalni rezultat zavisi od toga da kristal violet, jod, obezbojavanje i kontrastno bojenje deluju redom. Izostavljanje tih koraka menja ono što se na osnovu slike može utvrditi. Za tu razliku pogledajte jednostavno bojenje u odnosu na bojenje po Gramu.

Nigrozin pruža drugačiji način prikazivanja obrisa: zatamnjuje pozadinu, dok bakterijske ćelije ostaju relativno svetle. U Merck uputstvu za nigrozin postoji važan detalj koji opšti spisak zamena može da previdi. Njegova navedena radna formulacija sadrži formaldehid. Zbog toga se kompatibilnost sa živim ćelijama ne može zaključiti samo iz izraza „negativno bojenje”, iako same ćelije izgledaju neobojeno. Proverite kompletnu formulaciju i pripremu uzorka.

Za žive uzorke razmotrite promenu optike

Ako želite da posmatrate kretanje ili deobu ćelija, uvođenje druge boje može zakomplikovati posmatranje. Kao što Nikon objašnjava u svom vodiču o kontrastu kod providnih uzoraka, fazni kontrast i diferencijalni interferencioni kontrast, odnosno DIC, čine uzorke vidljivim zahvaljujući razlikama u njihovim optičkim svojstvima. Mogu prikazati žive, neobojene ćelije, pod uslovom da mikroskop ima potrebne komponente.

Ovim izborom preparat ostaje neobojen, ali se menja vrsta dostupnih informacija. Možete pratiti granicu ili kretanje bez saznanja koji je molekul proizveo kontrast. Ako je pitanje molekularna lokalizacija, umesto toga izaberite odgovarajuću metodu obeležavanja.

Za jedarnu DNK, Invitrogenovo poređenje DAPI i Hoechst boja razlikuje uobičajenu primenu DAPI sa fiksiranim ćelijama od Hoechst 33342, koji lakše ulazi u ćelije i preferira se za obeležavanje živih ćelija. Obe metode zahtevaju opremu za fluorescenciju. Nijedna nije direktna zamena za obojenu preparaciju u svetlom polju.

Izlaganje boji i osvetljenje tretirajte kao eksperimentalne uslove. Uporedite obojene i neobojene preparate kada merite ponašanje ćelija.

Crvena ćelija nije automatski mrtva ćelija

SYTO 9 i propidijum-jodid često se koriste zajedno za procenu integriteta bakterijske membrane. BacLight priručnik povezuje intaktne membrane sa zelenim bojenjem, a oštećene membrane sa crvenim bojenjem. Takvo tumačenje zahteva validaciju za konkretan uzorak.

Studija Rosenberga i saradnika iz 2019. godine ilustruje problem. U 24-časovnim biofilmovima E. coli na staklu u fosfatnom puferovanom fiziološkom rastvoru, oko 96% ćelija je in situ izgledalo pozitivno na propidijum-jodid. Ipak, autori su procenili da je 82% bilo sposobno za kultivaciju nakon prikupljanja. Konfokalne slike pokazale su ćelije sa zelenom unutrašnjošću ispod crveno obojenog materijala, što ukazuje na to da su vanćelijske nukleinske kiseline doprinele obmanjujućem signalu.

Ti procenti opisuju različita merenja na preparatima iz studije, a ne univerzalni korekcioni faktor. Korisna pouka je da treba proveriti šta je proizvelo signal. U biofilmu, boja za nukleinske kiseline može detektovati materijal izvan ćelija, kao i unutar oštećenih ćelija. Za zaključak o vijabilnosti istraživači preporučuju komplementarna merenja, kao što su kultivacija ili metabolička aktivnost, uz napomenu da svako od njih ima ograničenja.

Proverite šta alternativa zaista sadrži

Alternativna metoda bojenja i dalje može sadržati metilensko plavo. Giemsa je jedan primer: Merck opisuje svoj proizvod kao rastvor azure-eosin-methylene-blue, namenjen primenama koje uključuju razmaze krvi i koštane srži. To može biti drugačija metoda za drugačiji uzorak, ali ne ispunjava zahtev da se metilensko plavo isključi.

Ako je isključivanje nekog jedinjenja deo eksperimenta, proverite identitet i formulaciju reagensa pre poređenja slika. Vodič o methyl blue, methylene blue i bojama sa sličnim nazivima objašnjava razlike u nazivima.

Proverite zamenu pre korišćenja rezultata

Za novu metodu napravite malo poređenje koristeći reprezentativne uzorke i odgovarajuću kontrolu. Gde je moguće, održavajte postavke mikroskopa uporedivim. Zabeležite formulaciju reagensa, pripremu uzorka, izlaganje i uslove snimanja kako bi se slika koja izgleda bolje mogla ispitati, a ne samo preferirati.

Uspeh procenjujte u odnosu na prvobitno pitanje. Kod morfologije procenite da li granice i raspored ćelija ostaju razumljivi. Kod obeležavanja jedra procenite lokaciju signala i pozadinu. Kod vijabilnosti zahtevajte dokaze koji prevazilaze vizuelno privlačno razdvajanje boja. Širi vodič o bojenju metilenskim plavom i laboratorijskim primenama objašnjava kako se posmatranje i priprema uklapaju jedno s drugim.

Izaberite alternativu koja čuva merenje koje vam je potrebno. Boja je samo jedno svojstvo dobijene slike.