A mund ta anashkalojë bluja e metilenit kompleksin mitokondrial III? Pse studimet nuk pajtohen

Dy laboratorë pyetën nëse bluja e metilenit mund ta anashkalojë një kompleks mitokondrial III të bllokuar. Njëri u përgjigj jo. Tjetri u përgjigj po. Të dy kishin të dhëna.

Studimi i parë, në mitokondri të trurit të minjve, zbuloi se ngjyruesi nuk mund ta bëjë këtë. I dyti, në mitokondri të trurit nga tri specie brejtësish, zbuloi se mundet pjesërisht. Një studim i tretë, në mëlçinë e minjve, citohet shpesh në të njëjtin kontekst, por testoi diçka tjetër. Mbajeni në vendin që i takon dhe gjysma e paqartësisë zhduket.

Nuk ka ndonjë mekanizëm universal për të shpallur. Ka tri eksperimente me bllokues, doza dhe matje të ndryshme. Lexoni së pari kushtet. Përfundimet vijnë më pas.

Çfarë do të thotë anashkalim këtu

Elektronet hyjnë në zinxhir përmes kompleksit I (nga NADH) ose kompleksit II (nga sukcinati), kalojnë përmes kompleksit III te citokromi c, pastaj përmes kompleksit IV tek oksigjeni. Gradienti i krijuar gjatë rrugës është ai që qeliza shfrytëzon për të prodhuar ATP.

Një pretendim për anashkalim thotë se bluja e metilenit merr elektrone para një bllokimi dhe i dorëzon pas tij. Ngjyruesi i oksiduar merr elektrone nga NADH ose nga përbërësit e hershëm të zinxhirit, duke u shndërruar në leukoblu të metilenit, dhe forma e reduktuar ia dorëzon ato citokromit c ose i rikthen në zinxhir. Nëse dorëzimi bëhet pas bllokimit, frymëmarrja dhe potenciali i membranës rikuperohen pjesërisht. Nëse bëhet në pikën e bllokimit ose para saj, asgjë nuk rikuperohet.

Një hollësi e kompleksit III përcakton shumë nga kjo mosmarrëveshje. Kompleksi kryen një cikël Q me dy vende lidhjeje për inhibitorët. Antimicina lidhet në vendin Qi. Miksotiazoli lidhet në vendin Qo. Një studim që përdor vetëm njërin prej tyre ka testuar vetëm gjysmën e kompleksit.

Studimi i parë: pa anashkalim në mitokondritë e trurit të minjve

Gureev dhe kolegët përdorën mitokondri nga korteksi i minjve C57BL/6, të izoluara me digitoninë dhe të testuara në 0.1 mg proteinë për ml. Substratet përfshinin tri skema: piruvat plus malat, secili në 5 mM, sukcinat në 10 mM me glutamat në 2 mM, dhe L-prolinë në 10 mM. Bllokuesit ishin rotenoni në 1 micromolar (kompleksi I) dhe antimicina në 1 microgram për ml (kompleksi III). Dozat e ngjyruesit ishin 0.5, 1 dhe 2 micromolar, me 1 micromolar si përqendrimin kryesor. Metodat dhe gjurmët e regjistruara gjenden në komunikimin në FEBS Letters.

Anashkalimi i kompleksit I funksionoi. Rotenoni e uli frymëmarrjen e stimuluar nga ADP nga rreth 121 në rreth 2 nmol për minutë për mg, dhe ngjyruesi në 1 micromolar e riktheu në rreth 21. Potenciali i membranës u rikuperua me piruvat plus malat dhe me L-prolinë.

Anashkalimi i kompleksit III nuk funksionoi. Antimicina e uli frymëmarrjen në rreth 16, dhe ngjyruesi e çoi vetëm në rreth 20. Potenciali i membranës nuk u rikuperua me asnjë substrat, në doza të ngjyruesit deri në 5 micromolar. Të dhënat për peroksidin tregonin të njëjtën gjë: ngjyruesi i vetëm e rriti çlirimin e peroksidit nga një ritëm bazal afër 76 pmol për minutë për mg në afërsisht 1170, 1460 dhe 1945 në tri dozat, por antimicina e uli atë sinjal të nxitur nga ngjyruesi me rreth 25, 88 dhe 96 për qind, përkatësisht. Nëse ngjyruesi i reduktuar reagonte drejtpërdrejt me oksigjenin, bllokimi i kompleksit III nuk duhej ta zvogëlonte sinjalin. Autorët nxorën përfundimin se ngjyruesi i reduktuar oksidohet në vendin Qo të kompleksit III, para bllokimit nga antimicina. Qarku i shkurtër, me fjalë: dhuruesit te ngjyruesi, ngjyruesi te Qo, pastaj rruga normale më tej. Rotenoni anashkalohet. Antimicina jo.

Studimi i dytë: anashkalim i pjesshëm në tri specie, në të dy vendet e lidhjes së inhibitorëve

Svab dhe kolegët e zgjeruan planin eksperimental. Mitokondri të trurit nga minjtë, minjtë e gjirizeve dhe kaviet, të izoluara me Percoll, u testuan në të njëjtin përqendrim prej 0.1 mg për ml, me piruvat plus malat ose glutamat plus malat, secili në 5 mM. Ata përdorën dy bllokues të kompleksit III: antimicinë A në 0.3 micromolar dhe miksotiazol në 1 micromolar. Ngjyruesi ishte në 2 micromolar në shumicën e testeve, dhe në 0.5 në eksperimentet me citokromin c. Të tria speciet, me protokolle të njëjta, përfshihen në artikullin me qasje të hapur.

Të dy bllokimet u anashkaluan pjesërisht, në të tria speciet. Në mitokondritë e minjve, antimicina e frenoi frymëmarrjen dhe ngjyruesi e rriti me rreth 60 për qind, nga afërsisht 37 në 59 nmol për minutë për mg. Miksotiazoli e frenoi me 88 për qind, në rreth 4.5, dhe ngjyruesi e rriti pesëfish, në rreth 23. Potenciali i membranës u ripolarizua pjesërisht në prani të secilit inhibitor, i matur me dy ngjyrues (safraninë O dhe TMRM ratiometrik) për të përjashtuar artefaktet optike.

Ky artikull e testoi edhe dorëzimin e elektroneve drejtpërdrejt, gjë që studimi i parë nuk e bëri kurrë. Citokromi c ekzogjen i acetiluar në 25 micromolar nuk u reduktua nga mitokondritë e energjizuara, me ose pa inhibitorë, por shtimi i ngjyruesit nxiti reduktimin në të dy rastet. Në një tretësirë tampon pa qeliza, NADH plus ngjyruesi e reduktoi citokromin c me një ritëm proporcional me NADH. Kalimi më i gjatë, me fjalë: ekuivalentët reduktues te ngjyruesi, ngjyruesi drejtpërdrejt te citokromi c, kompleksi IV tek oksigjeni. Kjo rrugë e kapërcen tërësisht kompleksin III, prandaj të dy bllokuesit mund të anashkalohen.

Dy matje shtesë e mbështesin këtë interpretim. Fluoreshenca e NAD(P)H ra kur ngjyruesi iu shtua mitokondrive të trajtuara me miksotiazol, çka do të thotë se ekuivalentët reduktues rridhnin përmes rrugës së re. Gjithashtu, absorbanca e ngjyruesit në 660 nm pasqyroi me radhë çdo shtim, ndërsa supernatantet pas centrifugimit treguan se ngjyruesi i oksiduar grumbullohej brenda mitokondrive të energjizuara në një përqendrim mbi njëqind herë më të lartë, pastaj largohej kur potenciali binte. Edhe bilanci i protoneve përputhet: kapërcimi i hapave të pompimit lë afërsisht 2 protone për çift elektronesh në vend të 10, prandaj përdorimi më i shpejtë i oksigjenit me vetëm ripolarizim të pjesshëm është pamja e një anashkalimi të vërtetë, jo provë kundër tij.

I njëjti preparat prodhoi përgjigje që nuk lejojnë një lexim sipërfaqësor. Me inhibitor plus ngjyrues, ADP e uli frymëmarrjen në vend që ta rriste, dhe bllokimi i transportit e stimuloi në vend që ta ngadalësonte, ndërsa potenciali i membranës vazhdonte të ndryshonte në drejtimet normale. Konsumi i oksigjenit, i marrë i vetëm, të çon në përfundime të gabuara në këtë sistem.

Studimi i tretë: studimi në mëlçi që testoi komplekset I dhe II, jo III

Lee dhe Boelsterli përdorën mitokondri të mëlçisë së minjve dhe hepatocite në kulturë, të dëmtuara nga efavirenzi (kompleksi I, IC50 afër 30 micromolar) dhe hidrazina, metaboliti i izoniazidit (kompleksi II, IC50 afër 30 micromolar). Ngjyruesi në rreth 30 micromolar riktheu oksidimin e NADH, potencialin e membranës dhe ATP, ndërsa uli oksidantët dhe vdekjen nekrotike. Artikulli në Redox Biology e modelon këtë si transport elektronesh nga ngjyruesi duke anashkaluar komplekset I dhe II të dëmtuara.

Ky rezultat është një kontekst i konfirmuar për pjesën e mëparshme të zinxhirit dhe nuk thotë asgjë për kompleksin III, sepse asgjë nuk u bllokua aty. Ai nuk mund të konfirmojë apo të rrëzojë asnjërin nga studimet në tru.

Matrica e kushteve

Katër arsye pse të dy studimet e kompleksit III mund të kenë të drejtë për kushtet e tyre eksperimentale

1. Bllokuesi nuk përbënte të njëjtën ndërhyrje. Antimicinë e vetme në 1 microgram për ml kundrejt antimicinës në 0.3 micromolar plus një bllokues të veçantë të vendit Qo. Një rrugë e ngjyruesit që furnizon vendin Qo dështon pikërisht aty ku një rrugë drejtpërdrejt te citokromi c ka sukses. Një vend lidhjeje nuk mund të përfaqësojë të dy.

2. Doza e ngjyruesit dhe kohëzgjatja ndryshonin. Përqendrime kryesore prej 1 kundrejt 2 micromolar, për një përbërës që kryen cikle redoks dhe për të cilin marrja brenda mitokondrive dhe reduktimi i drejtpërdrejtë i citokromit c varen nga përqendrimi dhe koha. Dallime të vogla në dozë, së bashku me momente të ndryshme matjeje, mund të nxjerrin në pah degë të ndryshme të të njëjtit rrjet.

3. Preparatet ndryshonin. Izolimi me digitoninë kundrejt izolimit me gradient Percoll përzgjedh popullata mitokondriale që mbivendosen, por nuk janë identike. Përqendrimi i proteinës ishte i njëjtë, në 0.1 mg për ml, prandaj kjo ndryshore përjashtohet, por nënpopullata dhe integriteti jo. Gjithashtu, dyshimi për ndikimin e species u përjashtua: grupi i dytë e riprodhoi fenotipin e vet edhe te minjtë.

4. Gjendja e substratit përcakton çfarë mund të bëjë ngjyruesi. Tri skema substratesh kundrejt çifteve të lidhura me NADH. Furnizimi me NADH dhe potenciali i membranës përcaktojnë së bashku sa shpejt reduktohet ngjyruesi dhe ku shpërndahet, dhe një rrugë që kërkon ngjyrues të reduktuar pranë citokromit c të oksiduar varet nga kjo zgjedhje.

Si ta lexoni pretendimin e ardhshëm për anashkalim

Pyesni cili kompleks u bllokua, me cilin inhibitor, në cilin vend lidhjeje dhe në çfarë doze. Pyesni për përqendrimin e ngjyruesit dhe kur u krye matja. Pyesni për indin, specien, izolimin, përqendrimin e proteinës dhe substratin. Gjithashtu, pyesni nëse potenciali, frymëmarrja, gjendja redoks dhe një test i drejtpërdrejtë i dorëzimit të elektroneve përputhen, sepse konsumi i oksigjenit i marrë i vetëm çoi në drejtimin e gabuar më shumë se një herë këtu.

Përmbledhja me kufij të ngushtë qëndron. Për anashkalimin e kompleksit I nga ngjyruesi ka pajtim. Për kompleksin III, mitokondritë e minjve me antimicinë në 1 microgram për ml dhe ngjyrues në 1 micromolar nuk tregojnë anashkalim funksional, ndërsa tri specie me antimicinë në 0.3 micromolar ose miksotiazol në 1 micromolar dhe ngjyrues në 2 micromolar tregojnë anashkalim të pjesshëm me transferim të drejtpërdrejtë nga ngjyruesi te citokromi c. Këto fjali bashkëjetojnë. Çdo përfundim më i gjerë është ekstrapolim.

Leximet e lidhura e mbajnë pretendimin e diskutueshëm brenda kimisë së padiskutueshme: si i lëviz elektronet bluja e metilenit për përcjelljen, eksperimentet e anashkalimit të kompleksit I për rastin e konfirmuar në pjesën e mëparshme të zinxhirit, matjet e potencialit të membranës dhe artefaktet e tyre për arsyen pse nevojiteshin dy ngjyrues, dhe trajtimi laboratorik i përbërësve që kryejnë cikle redoks për kurthet e dozimit dhe kohës.