Alternativat ndaj blusë së metilenit për mikroskopi: zgjidhni sipas detyrës

Për një strisho të thjeshtë bakteriale, violeta kristal mund të zëvendësojë blunë e metilenit kur synimi është të shihet forma e qelizave. Për qelizat e gjalla, alternativa më e përshtatshme mund të jetë kontrasti fazor pa asnjë ngjyrues. Zgjedhja varet nga vëzhgimi që duhet të bëni.

Supozoni se dy persona po shqyrtojnë të njëjtën kulturë bakteriale. Njëri dëshiron të dallojë bakteret në formë shkopi nga qelizat e rrumbullakëta. Tjetri dëshiron të dijë nëse një trajtim i ka vrarë bakteret. Një ngjyrues që i jep personit të parë një imazh të qartë mund të mos i japë personit të dytë asnjë përgjigje të përdorshme.

Para se të zgjidhni një zëvendësues, plotësoni këtë fjali: “Duhet të vëzhgoj ___ në ___, dhe qelizat duhet / nuk është e nevojshme të mbeten të gjalla.” Kjo fjali përcakton detyrën që duhet të kryejë ngjyruesi.

Filloni me mostrën dhe pyetjen

Së pari vendosni nëse qelizat duhet të mbeten të gjalla, pastaj përcaktoni veçorinë që duhet të vëzhgoni:

• Qelizat duhet të mbeten të gjalla: për lëvizjen ose formën, merrni në konsideratë kontrastin fazor pa ngjyrosje ose DIC; për ADN-në bërthamore, merrni në konsideratë Hoechst 33342 me fluoreshencë; për integritetin e membranës, zgjidhni një analizë të validuar si SYTO 9 me propidium iodide.
• Qelizat nuk është e nevojshme të mbeten të gjalla: për morfologjinë bakteriale, merrni në konsideratë një ngjyrosje të thjeshtë me violetë kristal ose një ngjyrosje negative me nigrozinë; për reaksionin Gram, përdorni metodën e plotë të ngjyrosjes Gram; për ADN-në bërthamore në qeliza të fiksuara, merrni në konsideratë fluoreshencën DAPI.

Përdorni këtë tabelë për të krahasuar kufizimet e secilës degë. Këto janë zgjedhje metodash, jo udhëzime për të ndërruar shishet brenda një protokolli ekzistues.

Për një strisho të thjeshtë, zëvendësoni metodën me kujdes

Violeta kristal është një alternativë praktike kur detyra është një pamje njëngjyrëshe e morfologjisë bakteriale. Manuali Bakteriologjik Analitik i FDA-së rendit dy formulime me violetë kristal të përshtatshme për ngjyrosje të thjeshtë. Përdorni një formulim të dokumentuar dhe metodën e tij të përgatitjes; vetëm emri i ngjyruesit nuk përcakton një reagent pune.

Violeta kristal përdoret edhe në ngjyrosjen Gram, por kjo nuk e bën një ngjyrosje të thjeshtë me violetë kristal një ngjyrosje Gram. Në protokollin e ngjyrosjes Gram të ASM-së, rezultati diferencial varet nga veprimi në sekuencë i violetës kristal, jodit, çngjyrosjes dhe kundërngjyrosjes. Heqja e këtyre hapave ndryshon atë që mund të përcaktojë imazhi. Shihni ngjyrosjen e thjeshtë kundrejt ngjyrosjes Gram për këtë dallim.

Nigrozina ofron një mënyrë tjetër për të zbuluar konturet: ajo errëson sfondin, ndërsa qelizat bakteriale mbeten krahasimisht të çelëta. Ka një hollësi të dobishme në udhëzimet e Merck për nigrozinën që një listë e përgjithshme zëvendësuesish mund ta anashkalojë. Formulimi i specifikuar i punës përmban formaldehid. Prandaj, nuk mund të nxirrni përfundimin se metoda është e përshtatshme për qeliza të gjalla vetëm nga fjalët “ngjyrosje negative”, edhe pse vetë qelizat duken të pangjyrosura. Kontrolloni formulimin e plotë dhe përgatitjen e mostrës.

Për mostra të gjalla, merrni në konsideratë ndryshimin e optikës

Nëse dëshironi të vëzhgoni qelizat ndërsa lëvizin ose ndahen, shtimi i një ngjyruesi tjetër mund ta ndërlikojë vëzhgimin. Siç shpjegon Nikon në udhëzuesin e tij për kontrastin në mostra transparente, kontrasti fazor dhe kontrasti diferencial i interferencës, ose DIC, i bëjnë mostrat të dukshme përmes dallimeve në vetitë e tyre optike. Ato mund të zbulojnë qeliza të gjalla dhe të pangjyrosura, me kusht që mikroskopi të ketë komponentët e nevojshëm.

Kjo zgjedhje ruan një preparat të pangjyrosur, por ndryshon informacionin që mund të merret. Mund të ndiqni një kufi qelizor ose një lëvizje pa ditur se cila molekulë e krijoi kontrastin. Nëse pyetja lidhet me lokalizimin molekular, zgjidhni në vend të kësaj një metodë të përshtatshme etiketimi.

Për ADN-në bërthamore, krahasimi i ngjyruesve DAPI dhe Hoechst nga Invitrogen dallon përdorimin e zakonshëm të DAPI me qeliza të fiksuara nga Hoechst 33342, që depërton më lehtë në qeliza dhe preferohet për etiketimin e qelizave të gjalla. Të dy kërkojnë pajisje fluoreshence. Asnjëri nuk është zëvendësim i drejtpërdrejtë për një ngjyrues me ngjyrë për mikroskopi me fushë të ndritshme.

Trajtojini ekspozimin ndaj ngjyruesit dhe ndriçimin si kushte eksperimentale. Krahasoni preparatet e ngjyrosura dhe të pangjyrosura kur matja juaj është sjellja e qelizave.

Një qelizë e kuqe nuk është automatikisht një qelizë e vdekur

SYTO 9 dhe propidium iodide përdoren shpesh së bashku për të vlerësuar integritetin e membranës bakteriale. Manuali BacLight i lidh membranat e paprekura me ngjyrosjen e gjelbër dhe membranat e dëmtuara me ngjyrosjen e kuqe. Ky interpretim duhet të validohet për mostrën.

Një studim i vitit 2019 nga Rosenberg dhe kolegët e ilustron problemin. Në biofilmat 24-orëshe të E. coli mbi qelq në tretësirë fiziologjike të tamponuar me fosfat, rreth 96% e qelizave u shfaqën pozitive për propidium iodide in situ. Megjithatë, autorët vlerësuan se 82% ishin të kultivueshme pas mbledhjes. Imazhet konfokale treguan qeliza me pjesë të brendshme të gjelbra nën material të ngjyrosur me të kuqe, duke treguar se acidet nukleike jashtëqelizore kontribuonin në sinjalin çorientues.

Këto përqindje përshkruajnë matje të ndryshme në preparatet e studimit, jo një faktor universal korrigjimi. Mësimi i dobishëm është të kontrolloni se çfarë e gjeneroi sinjalin. Në një biofilm, një ngjyrues i acideve nukleike mund të zbulojë material jashtë qelizave, si edhe brenda qelizave të dëmtuara. Për një përfundim mbi viabilitetin, studiuesit rekomandojnë matje plotësuese, si kultivimi ose aktiviteti metabolik, duke pranuar se secila ka kufizime.

Kontrolloni se çfarë përmban realisht alternativa

Një metodë alternative ngjyrosjeje mund të përmbajë përsëri blu metileni. Giemsa është një shembull: Merck e përshkruan produktin e vet si një tretësirë azure-eosin-methylene-blue, e destinuar për përdorime që përfshijnë strishot e gjakut dhe palcës së kockave. Mund të jetë një metodë tjetër për një mostër tjetër, por nuk plotëson një kërkesë për të përjashtuar blunë e metilenit.

Nëse përjashtimi i një përbërësi është pjesë e eksperimentit, kontrolloni identitetin dhe formulimin e reagentit para se të krahasoni imazhet. Udhëzuesi për methyl blue, methylene blue dhe ngjyrues të tjerë me emra të ngjashëm trajton dallimet në emërtim.

Verifikoni zëvendësimin para se të përdorni rezultatin

Për një metodë të re, bëni një krahasim të vogël duke përdorur mostra përfaqësuese dhe një kontroll të përshtatshëm. Mbajini cilësimet e mikroskopit të krahasueshme kur është e mundur. Regjistroni formulimin e reagentit, përgatitjen e mostrës, ekspozimin dhe kushtet e imazherisë, në mënyrë që një imazh me pamje më të mirë të mund të hetohet dhe jo thjesht të preferohet.

Vlerësoni suksesin sipas pyetjes fillestare. Për morfologjinë, vlerësoni nëse kufijtë dhe renditja e qelizave mbeten të interpretueshme. Për etiketimin bërthamor, vlerësoni vendndodhjen e sinjalit dhe sfondin. Për viabilitetin, kërkoni prova përtej një ndarjeje tërheqëse të ngjyrave. Udhëzuesi më i gjerë për ngjyrosjen me blu metileni dhe përdorimet laboratorike shpjegon se si lidhen vëzhgimi dhe përgatitja.

Zgjidhni alternativën që ruan matjen që ju nevojitet. Ngjyra është vetëm një nga vetitë e imazhit që rezulton.