Identifikacija metilenskega modrila v laboratoriju: infrardeči spektri in dopolnilne metode

Predstavljajte si, da trije laboratoriji prejmejo isti modri prašek. Prvi posname infrardeči spekter in ga opredeli kot metilensko modrilo. Drugi opravi kromatografijo in poroča o 0.4% Azure B. Tretji z rentgensko difrakcijo kristalov določi hidratno obliko. Vsi trije imajo prav, vendar nobeden ni odgovoril na drugi dve vprašanji. Zmeda nastane, ko en rezultat razumemo kot odgovor na vsa tri.

Ta članek ta vprašanja ločuje. Infrardeča identifikacija ugotavlja molekulsko identiteto s primerjavo z referenčnim standardom. Kromatografija ugotavlja sestavo. Difrakcija ugotavlja obliko v trdnem stanju. Ustrezno ujemanje pri identifikaciji ni potrdilo o čistosti.

Infrardeča identifikacija dobro odgovori na eno vprašanje

Farmakopejski identifikacijski preskus za metilensko modrilo temelji na primerjavi spektra s standardom, ne na seznamu vrhov. V predogledu monografije USP za metilensko modrilo je pri identifikaciji A navedena infrardeča spektroskopija z optiko ATR ali s tableto kalijevega bromida. Spekter vzorca mora ustrezati spektru referenčnega standarda USP, pri čemer morata biti vzorec in standard pripravljena in posneta pod enakovrednimi pogoji. O izidu ne odloča določen seznam diagnostičnih valovnih števil, temveč prekrivanje spektrov.

Takšna zasnova odraža značilnosti spektrov FTIR metilenskega modrila. Najizrazitejše značilnosti so v območju prstnega odtisa. Pripisi v literaturi glavni pas konjugiranih obročev dosledno umeščajo v bližino 1590 do 1600 cm-1, kjer se sklopijo nihanja raztezanja aromatskih vezi ogljik–ogljik in ogljik–dušik. Dodatni pasovi v bližini 1490 in 1390 cm-1 vključujejo deformacijska nihanja obročev ter vezi ogljik–dušik in ogljik–vodik. Pasovi v bližini 1355 in 1330 cm-1 vključujejo vezi ogljik–dušik v dimetilaminskih skupinah in deformacije metilnih skupin. Značilnosti v bližini 1225 do 1250 cm-1 pripadajo heterocikličnemu ogrodju, pasovi v bližini 1170 do 1130 in 1066 cm-1 pa vključujejo nihanja vezi ogljik–žveplo; upogibanje aromatskih vezi C-H je v bližini 880 cm-1. Nihanja raztezanja se pojavljajo pri višjih valovnih številih: aromatske vezi C-H v bližini 3040 cm-1 in vezi C-H v N-metilnih skupinah približno med 2900 in 3000 cm-1. Objavljeni pripisi se v podrobnostih razlikujejo, ker fenotiazinsko kationsko ogrodje niha kot sklopljen sistem, zato vsako posamezno tabelo pripisov obravnavajte kot objavljeno razlago, ne kot edino možno.

Pozornost si zaslužita dva vpliva priprave, saj spreminjata IR spektre metilenskega modrila, ne da bi spremenila barvilo. Prvič, hidratirani material kaže širok pas O-H okoli 3300 do 3500 cm-1 in upogibno nihanje vode v bližini 1630 do 1640 cm-1, različne hidratne oblike pa merljivo premaknejo pasove v območju prstnega odtisa. Drugič, matrica tablete KBr je higroskopna: absorbirana vlaga povzroči pasove prav v teh območjih vode in jo lahko zamenjamo za hidratno vodo v vzorcu. Merjenje z ATR se izogne matrici KBr, vendar so intenzitete pri ATR odvisne od globine prodiranja, ki se spreminja z valovnim številom, zato spektra ATR in transmisijskega spektra istega praška ni mogoče neposredno prekriti. Praktično pravilo izhaja iz farmakopejske zahteve: primerjajte vzorec in referenco, posneta z isto tehniko, ter zabeležite, katera je bila uporabljena. Za osnovno kemijo kationa, soli in hidratov, ki je v ozadju teh spektrov, glejte referenčni pregled strukture in lastnosti metilenskega modrila.

Tabela za izbiro analitske metode

Ta tabela je pripomoček za izbiro. V posamezni vrstici preberite, na katero vprašanje metoda odgovarja, kaj potrdi ustrezen rezultat in kaj ostaja nedokazano.

Zakaj ujemanje infrardečih spektrov ni potrdilo o čistosti

Ujemanje pri identifikaciji izključi napačno barvilo. Ne poda pa popisa sestavin vzorca. Najpomembnejše so tri omejitve.

Prvič, sorodna barvila so si v infrardečem območju podobna. Azure B se od metilenskega modrila razlikuje za eno samo metilno skupino, zato je njegov spekter zelo podoben spektru metilenskega modrila. Zmes z nekaj odstotki Azure B se še vedno dobro prekriva z referenčnim spektrom metilenskega modrila. Zaznavanje te nečistote je naloga kromatografije, opisane v vodniku po nečistotah metilenskega modrila in preskusnih metodah.

Drugič, infrardeča spektroskopija obravnava vzorec kot celoto in ima omejeno občutljivost za manj zastopane sestavine. Majhne količine sorodnih barvil, ostankov topil ali anorganskih ostankov se skrijejo pod glavnimi pasovi. Odsotnost dodatnih vrhov je šibek dokaz odsotnosti nečistot.

Tretjič, referenčni standard določa celotno primerjavo. Razgrajen standard, standard s spektralnimi premiki zaradi hidratacije ali standard, s katerim se je neustrezno ravnalo, spremeni merila. Enako velja za neujemajoči se tehniki, na primer ko spekter vzorca ATR ocenjujemo glede na referenco KBr. Ob vsakem zaključku zabeležite serijo standarda, tehniko in pripravo.

Pri zmeseh velja še zadnje opozorilo. Spekter, ki se večinoma ujema, vendar ima ramena ali nepravilnosti v intenziteti, ni ustrezen rezultat z opombami. Je znak, da je treba sestavine vzorca pred identifikacijo ločiti.

Dopolnilne metode v praksi

HPLC metilenskega modrila poda odgovor o sestavi, ki ga infrardeča spektroskopija ne more. Trenutna farmakopejska metoda uporablja kolono fenilnega tipa z gradientom voda–acetonitril, ki vsebuje trifluoroocetno kislino, ter zaznavanje pri 246 nm, ne v vidnem območju. Identiteta izhaja iz ujemanja retencijskega časa z referenčnim standardom; ista primerjava omogoča določanje vsebnosti. Preskus organskih nečistot določa Azure B z lastnim referenčnim materialom pri relativni retenciji okoli 0.8 glede na metilensko modrilo pri 1.0 in zahteva visoko ločljivost med obema vrhovoma. Bodite pozorni na izbiro valovne dolžine: absorpcija v demetilacijskem nizu se postopoma pomika proti rdečemu delu spektra, od tionina v bližini 600 nm prek Azure C, Azure A in Azure B do metilenskega modrila v bližini 670 nm. Detektor, nastavljen v bližini 660 nm, se zato na člane niza odziva neenako in podcenjuje nekatere homologe. Celovit profil celotnega niza, kadar je potreben, je treba določiti z metodo C18 LC-MS/MS z ustrezno kvalificiranimi standardi za vsak analit.

Praškovna difrakcija odgovarja na vprašanje o trdnem stanju, katerega informacije zgornji metodi bodisi uničita bodisi prezreta: raztapljanje praška za kromatografijo izbriše informacije o kristalih, molekulska nihanja pa opisujejo vezi, ne urejenosti na dolge razdalje. Difrakcijski vzorci razlikujejo hidratne faze in kristaliničnost, metilensko modrilo pa takšno preverjanje potrebuje bolj kot večina materialov. Rager in sodelavci so pri raziskavah trdnega stanja identificirali pet različnih hidratnih struktur, vključno s pentahidratom, dvema dihidratoma, monohidratom in vmesnim hidratom, med opredeljenimi oblikami pa niso našli pravega trihidrata. Pri tem je pomembno laboratorijsko ravnanje: vlaga in temperatura spreminjata stabilnost hidratov, intenzivno mletje pa lahko spremeni fazo ali zmanjša kristaliničnost, zato nadzorujte in beležite relativno vlažnost in temperaturo ter mletje omejite na najmanjšo možno mero. Označevanje hidratov in njegov vpliv na stehtano maso sta podrobneje obravnavana v članku hidratne oblike metilenskega modrila in njihovo označevanje.

Absorpcija UV-Vis ima podporno vlogo. Znani maksimumi potrjujejo pričakovano vedenje raztopine in omogočajo določanje koncentracije, vendar je modra raztopina, ki absorbira pri pričakovani valovni dolžini, le skladna z metilenskim modrilom, ne pa dokaz njegove identitete, saj sorodna barvila absorbirajo v bližini.

Kaj vprašati pred nakupom

Te razlike prenesite v vprašanja ob nakupu. Vprašajte, katera serija je bila preskušena, s katero tehniko je bila ugotovljena identiteta, ali je bil pri preskusu nečistot s HPLC uporabljen referenčni material Azure B in ali je bila hidratna oblika opredeljena ali predpostavljena. Predvsem vprašajte, ali potrdilo zajema celotno specifikacijo ali samo izbrane preskuse. Številni prodajalci, ki zatrjujejo skladnost s farmakopejo, preskušajo le težke kovine, zato vprašanja identitete, vsebnosti, organskih nečistot, topil in mikrobiološke kakovosti ostajajo neodgovorjena.

Blupreme v sodelovanju s farmacevtskim proizvajalcem metilenskega modrila izvaja preskuse po celotni specifikaciji USP, ki zajema identiteto, čistost, organske nečistote, ostanke topil, elementne nečistote, ostanek po žarenju, mikrobiološke meje in bakterijske endotoksine. Javno potrdilo o analizi za vsako serijo je objavljeno na strani preskušanje kakovosti Blupreme, zato je osnovo za določanje vsebnosti in rezultate za nečistote mogoče neposredno prebrati, namesto da bi o njih sklepali. Tudi pri rezultatih blizu 100% mora biti navedena osnova za izračun, kot pojasnjuje vodnik o vsebnosti nad 100 odstotki. Ujemanje pri identifikaciji preiskavo začne. Celotna dokumentacija jo zaključi.