Rozpustnosť metylénovej modrej vo vode a príprava roztoku z prášku

Dvaja laboranti pripravujú z prášku 1-percentný roztok metylénovej modrej. Jeden naváži 1.00 gramu a doplní odmernú banku na 100 mL. Druhý naváži 1.00 gramu, pridá ho do 100 mL vody a považuje prípravu za hotovú. Tretí laborant naváži 1.00 gramu z inej šarže a získa merateľne odlišnú koncentráciu. Všetky tri fľaše sú označené rovnako. Ani jedna neobsahuje presne to, čo uvádza etiketa, a rozdiely vyplývajú z troch pojmov, ktoré sa ľahko zamieňajú: koľko látky dokáže rozpúšťadlo rozpustiť, čo navážený prášok skutočne obsahuje a na čo sa vzťahuje percentuálny údaj.

Táto príručka sa týka výlučne prípravy laboratórnych roztokov: farbiacich roztokov, indikátorov, analytických zásobných roztokov a pracovných riedení. Nie je návodom na prípravu liekov na perorálne ani injekčné podanie a uvedené koncentrácie sa nemajú chápať ako dávky.

Čo určuje rozpustnosť a čo nie

Rozpustnosť metylénovej modrej vo vode je na farbivo vysoká. Záznam o metylénovej modrej v databáze PubChem uvádza približne 43.6 gramu na liter pri 25 C, čo zodpovedá 4.36 gramu na 100 mL alebo 4.36 percenta w/v. Nezávislá štúdia rovnovážnej rozpustnosti pri rovnakej teplote namerala 43.21 g/L a potvrdila staršiu hodnotu v rámci experimentálnej chyby.

Toto číslo je horná hranica, nie cieľová hodnota. 1-percentný zásobný roztok má koncentráciu 10 g/L, čo je menej než štvrtina tejto hranice. 0.1-percentný zásobný roztok má koncentráciu 1 g/L, teda približne jednu štyridsatinu. Ak v 1-percentnom roztoku po riadnom premiešaní pri izbovej teplote zostávajú pevné častice, problémom takmer nikdy nie je hranica rozpustnosti. Zvyčajne ide o neúplné zmáčanie, studenú vodu, hrudky prášku, ktoré potrebujú viac času, alebo nesprávne identifikovanú rozpúšťanú látku. Teplá voda a miešanie vyriešia väčšinu týchto problémov. Ak ste použili zahrievanie, pred doplnením na konečný objem nechajte banku opäť dosiahnuť teplotu, pri ktorej bola kalibrovaná.

Rozpustnosť v iných rozpúšťadlách je nižšia a údaje z rôznych zdrojov sa menej zhodujú, čiastočne preto, že skúšaný materiál má odlišný hydratačný stav. Voda zostáva referenčným rozpúšťadlom na bežné laboratórne zásobné roztoky. Etanol farbivo rozpúšťa, ale rozpustí ho podstatne menej než voda; chloroform ho tiež rozpúšťa, pyridín iba mierne a dietyléter prakticky vôbec. V sériách meraní vykazujú acetón a etylacetát výrazne nižšiu rozpustnosť než voda. Pri práci v nevodnom prostredí považujte akýkoľvek tabuľkový údaj za počiatočný odhad a overte ho na konkrétnej šarži, nie za záväznú hranicu pri príprave roztoku. Praktický záver je jednoduchý: ak je cieľom presne definovaná koncentrácia vo vodnom roztoku na úrovni 1 percenta alebo nižšia, voda poskytuje veľkú rezervu.

Prášok nemá vždy rovnaké zloženie

Prášková metylénová modrá predávaná na laboratórne použitie je chloridová soľ, ktorá vo svojej kryštálovej mriežke obsahuje vodu, pričom jej množstvo sa mení. Bezvodý ión má molárnu hmotnosť 319.85 g/mol. Bežne uvádzaný trihydrát má 373.90 g/mol a pentahydrát 409.93 g/mol; tieto hodnoty sú uvedené v údajoch z monografie USP zhrnutých pri zázname v databáze PubChem.

Komerčné balenia sú často označené ako trihydrát, CAS 7220-79-3, ale štúdie pevnej fázy ukázali, že skutočný materiál môže byť pentahydrát, čiastočný hydrát s približne 2.2 molekulami vody, dihydrát alebo monohydrát, pričom niektoré analýzy nezistili samostatnú kryštalickú fázu trihydrátu. Farbivo je tiež hygroskopické, takže obsah vody v otvorenom balení sa postupne mení. Pri kvalitatívnom farbení to má len malý význam. Pri kvantitatívnej analytickej práci je to veľmi dôležité, preto návod na interpretáciu stanoveného obsahu a obsahu vody v certifikáte analýzy považuje dokumentáciu šarže za rozhodujúcu, nie slovo trihydrát na prednej etikete.

Z toho vyplývajú dva spôsoby korekcie, pričom naraz sa má použiť iba jeden. Ak certifikát uvádza stanovený obsah a obsah vody alebo stratu sušením, použite priamo tieto údaje. Ak údaje z certifikátu nie sú k dispozícii a koncentrácia sa musí vyjadriť ako bezvodý ekvivalent, použite teoretický hydrátový faktor: 373.90 delené 319.85, čiže 1.169, pre nominálny trihydrát a 409.93 delené 319.85, čiže 1.282, pre nominálny pentahydrát. Nepoužívajte obe korekcie súčasne. Vodu by ste tak započítali dvakrát.

Čo znamená percentuálna koncentrácia

Percento w/v znamená gramy špecifikovanej rozpustenej látky na 100 mL konečného roztoku, nie na 100 mL východiskovej vody. Preto 1 percento w/v predstavuje 1.000 g na 100 mL konečného roztoku, čo sa rovná 10 mg/mL alebo 10 g/L. 0.1-percentný roztok obsahuje 0.100 g na 100 mL konečného roztoku, čo sa rovná 1 mg/mL. Bežná zámena 1 percenta s 1 mg/mL je desaťnásobná chyba a oplatí sa z tohto hľadiska skontrolovať každú etiketu.

Druhou časťou definície je špecifikácia rozpustenej látky. 1-percentný roztok pripravený podľa hmotnosti naváženého práškového trihydrátu a 1-percentný roztok vyjadrený ako bezvodý ekvivalent sú odlišné roztoky. Nasledujúce príklady vždy uvádzajú konečný objem aj základ vyjadrenia koncentrácie. Práve tento návyk predchádza problému troch laborantov opísanému vyššie.

Príklady prípravy s uvedenými predpokladmi o hydráte

Všetky príklady predpokladajú čistý prášok uvedeného hydrátu a vodu ako rozpúšťadlo pri izbovej teplote. Pre iné objemy prepočítajte množstvá priamo úmerne.

Príklad A: 100.0 mL roztoku s koncentráciou 1 percento w/v, na základe hmotnosti naváženého trihydrátu. Navážte 1.000 g trihydrátu metylénovej modrej. Pridajte približne 70 mL čistenej vody, miešajte alebo krúžte nádobou až do úplného rozpustenia, kvantitatívne preneste roztok do 100.0 mL odmernej banky vrátane oplachov a potom doplňte vodou po rysku. Rozpustenou látkou je samotný trihydrát, preto sa neuplatňuje korekcia na molárnu hmotnosť. Výsledok: 1.000 g na 100.0 mL konečného roztoku, čiže 10 mg/mL naváženého prášku.

Príklad B: 100.0 mL roztoku s koncentráciou 1 mg/mL, vyjadrenou ako bezvodý ekvivalent, z nominálneho trihydrátu. Cieľom je 100.0 mg bezvodej metylénovej modrej v 100.0 mL konečného roztoku. Vynásobte faktorom 1.169 na zohľadnenie troch molekúl vody: 100.0 mg krát 1.169 sa rovná 116.9 mg. Navážte 116.9 mg nominálneho trihydrátu, rozpustite ho v približne 70 mL vody a v odmernej banke doplňte na konečný objem 100.0 mL. Pri nominálnom pentahydráte je faktor 1.282, takže na rovnaký cieľ potrebujete 128.2 mg. Na etikete zaznamenajte, ktorý faktor ste použili.

Príklad C: riedenie metylénovej modrej z 1-percentného zásobného roztoku na 0.1 percenta. Použite vzťah C1V1 sa rovná C2V2. Na prípravu 100.0 mL 0.1-percentného roztoku z 1.0-percentného zásobného roztoku je potrebný objem zásobného roztoku 0.1 krát 100.0 delené 1.0, čo je 10.0 mL. Napipetujte 10.0 mL 1-percentného zásobného roztoku do 100.0 mL odmernej banky a doplňte vodou po rysku. Pre analytikov, ktorí uprednostňujú hmotnostné jednotky: 1 percento je 10 mg/mL, takže 10.0 mL obsahuje 100 mg a 100 mg v 100.0 mL konečného roztoku predstavuje 1 mg/mL, teda 0.1 percenta.

Príklad D: 1.000 L pracovného roztoku s koncentráciou 10 mg/L zo zásobného roztoku s koncentráciou 1 mg/mL. Zásobný roztok s koncentráciou 1 mg/mL má koncentráciu 1000 mg/L. Potrebný objem je 10 krát 1.000 delené 1000, čo je 0.0100 L alebo 10.0 mL. Napipetujte 10.0 mL zásobného roztoku a zrieďte vodou na konečný objem 1.000 L. Z 1-percentného zásobného roztoku s koncentráciou 10,000 mg/L potrebujete na rovnaký cieľ iba 1.00 mL doplnený na 1.000 L. Sériové riedenie v dvoch krokoch poskytuje lepšiu presnosť než jednorazový prenos mikrolitrového objemu, ak pomer presahuje približne sto.

Každý z týchto príkladov predstavuje úplnú špecifikáciu len preto, že obsahuje tri údaje: naváženú hmotnosť s predpokladanou formou hydrátu, konečný objem roztoku a základ vyjadrenia uvedenej koncentrácie. Záznam v laboratórnom denníku, v ktorom chýba čo i len jeden z týchto troch údajov, nemožno presne reprodukovať.

Postup, ktorý predchádza bežným chybám

Najprv rozpustite prášok v objeme menšom než konečný objem a potom doplňte na požadovaný objem. Pridaním prášku priamo do celého konečného objemu vody vznikne roztok, ktorého celkový objem presahuje zamýšľanú rysku, a výsledná koncentrácia bude nižšia. Kadičku vypláchnite do odmernej banky, aby v nej nezostalo žiadne farbivo; sýta farba zviditeľňuje aj malé straty, čo je výhodou, ak vás vedie ku kvantitatívnemu prenosu.

Pred doplnením na konečný objem miešajte, kým nezostanú žiadne častice, a skontrolujte roztok proti svetlu. Filtrujte iba vtedy, keď to vyžaduje metóda. Metylénová modrá sa adsorbuje na niektoré membránové materiály, preto môže filtrácia znížiť koncentráciu práve štandardizovaného zásobného roztoku. Tento jav je zdokumentovaný v štúdiách adsorpcie na membránach a treba naň pamätať vždy, keď je filtrácia alebo overenie koncentrácie súčasťou metódy. Ak musí mať filtrovaný zásobný roztok certifikovanú koncentráciu, overte ju po filtrácii, nie pred ňou.

Pripravené roztoky skladujte pri izbovej teplote v hnedých alebo nepriehľadných fľašiach chránených pred silným svetlom a na etikete uveďte rozpustenú látku, hydrátový základ, koncentráciu, rozpúšťadlo, dátum a osobu, ktorá roztok pripravila. Fotoblednutie pri dlhodobom osvetlení je známou cestou degradácie, preto sú okenné parapety a osvetlené chladničky nevhodným miestom na skladovanie, aj keď farbivo vyzerá stabilne. Očakávaná stabilita a intervaly opakovaného skúšania patria do pokynov na skladovanie a stabilitu pripravených roztokov, ale praktickým pravidlom je, že analytické zásobné roztoky si zaslúžia čerstvú prípravu alebo opätovné overenie, nie neobmedzenú dôveru.

Pri manipulácii s práškom a koncentrovanými zásobnými roztokmi používajte rukavice, ochranu očí, laboratórny plášť a ochranné zakrytie pracovnej plochy; fľaše umiestnite do sekundárnej záchytnej nádoby. Farbivo rýchlo zafarbuje pokožku, oblečenie, pracovné plochy a plasty a karty bezpečnostných údajov dodávateľov klasifikujú prášok podľa stupňa kvality ako škodlivý po požití a dráždivý pre oči a pokožku. Úplné bezpečnostné opatrenia patria do postupov bezpečnej manipulácie a skladovania, ale obmedzovanie nechceného zafarbenia je samo osebe opatrením na zabezpečenie kvality: zvyšky farbiva na laboratórnom skle a pipetách sú zdrojom krížovej kontaminácie pri stopovej analýze.

Poznámka k stupňu kvality

Na farbiace kúpele a demonštrácie postačuje akýkoľvek čistý materiál laboratórnej kvality pripravený na správnu koncentráciu. Pri kvantitatívnej alebo porovnávacej práci je stupeň kvality dôležitý, pretože nečistoty sa líšia: zvyškový Azure B a príbuzné tiazíny, ťažké kovy, zvyškové rozpúšťadlá a mikrobiálna záťaž. Preto je výber stupňa kvality doloženého úplným certifikátom analýzy súčasťou prípravy roztoku, nie dodatočnou úvahou. Úplná dokumentácia šarže uvádza identitu, stanovený obsah so základom jeho vyjadrenia, obsah vody a súbor nečistôt, ktoré sa skutočne testovali, takže korekcia na hydrát v uvedených príkladoch využíva namerané hodnoty namiesto predpokladu nominálneho trihydrátu. Keď dve šarže pri rovnakej naváženej hmotnosti poskytujú odlišné koncentrácie, certifikát zvyčajne vysvetlí prečo.