Metylénová modrá a zrak: čo ukazuje výskum sietnice a kde sa končí

Čitateľ nájde štúdiu, v ktorej metylénová modrá chránila sietnicu, a položí si prirodzenú otázku: mala by sa aplikovať do oka? Výskum metylénovej modrej v súvislosti so zrakom na túto otázku neodpovedá, pretože žiadna z kľúčových štúdií takéto použitie netestovala. V jednej sa farbivo vstreklo do sklovca myší spolu s toxínom. V ďalšej sa pridalo do média obklopujúceho izolované bunky v kultivačnej miske. V tretej sa podávalo v pitnej vode mutantným myšiam. Každý výsledok sa vzťahuje na konkrétny spôsob podania a konkrétny model.

Tento článok rozoberá tri predklinické štúdie, dva typy buniek sietnice a hranicu medzi ochranou v laboratóriu a klinickou liečbou očí. Zistenia majú spoločný vzorec: metylénová modrá môže za kontrolovaných podmienok ovplyvňovať mitochondriálny stres v bunkách sietnice, no toto zistenie neopodstatňuje aplikáciu maloobchodných roztokov do oka.

Dva typy buniek, dve odlišné ochorenia

Sietnica má viacero vrstiev a záleží na tom, o ktorú vrstvu ide. Svetlo najprv dopadá na fotoreceptory vo vonkajšej časti sietnice. Ich signály prechádzajú cez sprostredkujúce neuróny do gangliových buniek vo vnútornej časti sietnice, ktorých axóny ju opúšťajú cez zrakový nerv. Nasledujúca schéma pomenúva vrstvy v ich poradí.

Gangliové bunky sietnice sú bunky ohrozené pri glaukóme a neuropatii zrakového nervu. Keď vyhľadávania spájajú metylénovú modrú s glaukómom, zvyčajne sa týkajú tejto vnútornej vrstvy a jej axónov. Fotoreceptory sú bunky ohrozené pri degenerácii vonkajšej časti sietnice. Majú najvyššie energetické nároky v sietnici a fungujú blízko hranice svojej respiračnej kapacity, takže pri zlyhaní mitochondriálneho komplexu I im zostáva len malá rezerva. Výsledok pri jednom type buniek sa nedá preniesť na druhý a tri nižšie uvedené štúdie ich posudzujú oddelene. Všeobecný postup oddeľovania modelov od záverov vysvetľuje článok ako čítať výskum metylénovej modrej.

Gangliové bunky v živom myšom oku

V najstaršej z týchto troch štúdií výskumníci modelovali neuropatiu zrakového nervu mikroinjekciou rotenónu do sklovca jedného myšieho oka, pričom druhé oko slúžilo ako kontrola s nosičom. Rotenón blokuje mitochondriálny komplex I, vstupný bod, ktorý odovzdáva elektróny z NADH ďalej. Dysfunkcia komplexu I je tiež znakom, ktorý spája tento model s Leberovou hereditárnou optickou neuropatiou, ochorením gangliových buniek a zrakového nervu.

Po dvadsiatich štyroch hodinách bola vrstva gangliových buniek v očiach vystavených rotenónu tenšia a obsahovala menej buniek než v kontrolných očiach. Keď sa metylénová modrá vstrekla spolu s rotenónom, tomuto poškodeniu sa zabránilo v závislosti od dávky. Najvyššia testovaná dávka (0.07 mg/kg, výrazne pod myšou LD50) zachovala hrúbku vrstvy aj počet buniek. Súbežné testy v mozgových homogenátoch ukázali dva účinky: metylénová modrá zvrátila oxidačný stres vyvolaný rotenónom aj pokles spotreby kyslíka. Autori navrhli excitotoxický mechanizmus, pri ktorom rotenón poškodzuje modulačné amakrinné bunky, gangliové bunky nadmerne vysielajú vzruchy a antioxidačné pôsobenie prerušuje vznikajúce poškodenie. Navrhované chemické procesy v pozadí tejto ochrany podrobne opisuje článok mitochondriálne mechanizmy metylénovej modrej.

Tento výsledok má tri obmedzenia. Farbivo sa vstreklo spolu s toxínom priamo do oka, čo je spôsob podania, nie liečebný režim. Pozorovanie trvalo 24 hodín. A namerané hodnoty cytochrómoxidázy vzrástli v oboch skupinách s poškodením, čo autori vyhodnotili ako nadmernú aktivitu, nie ako dôkaz obnovenej respirácie v živej sietnici.

Gangliové bunky izolované v kultivačnej miske

Druhá štúdia oko úplne vynechala. Výskumníci izolovali primárne gangliové bunky sietnice z mladých potkanov a vystavili ich rotenónu, induktoru apoptózy staurosporínu alebo 72 hodinám nízkej hladiny kyslíka. Potom merali prežívanie farbením rozlišujúcim živé a mŕtve bunky. Metylénová modrá v kultivačnom médiu pri koncentráciách 1 a 10 mikromolárnych zlepšila prežívanie pri každom z týchto zásahov, približne 1.5- až 1.9-násobne podľa podmienok. Sprievodný test ukázal, že metylénová modrá zachovala aktivitu cytochróm c oxidázy pri pôsobení peroxidu vodíka.

Ide o farmakológiu izolovaných buniek. Látka sa dostala k bunkám difúziou cez kultivačné médium pri stanovenej koncentrácii, bez rohovky, slzného filmu, šošovky, sklovca, krvného zásobenia či imunitného systému v ceste. Práve táto jednoduchosť je zmyslom modelu: ukazuje, že samotné gangliové bunky možno chrániť, keď sa k nim látka dostane. Nehovorí nič o tom, či by kvapka na povrchu rohovky zabezpečila akúkoľvek stanovenú koncentráciu vo vnútornej časti sietnice. Koncentráciám nad 10 mikromolárnych sa výskumníci vyhli pre toxicitu voči tým istým bunkám. Pripomína to, že závislosť odpovede od dávky môže v kultivačnej miske pôsobiť oboma smermi.

Fotoreceptory mutantných myší a bunková línia

Tretia štúdia sa týka vonkajšej časti sietnice. Výskumníci použili myši Harlequin s nedostatkom faktora indukujúceho apoptózu, ktorý vedie k neúplnému zostaveniu komplexu I, a vo veku 11 mesiacov skúmali štruktúru fotoreceptorov, markery vonkajších segmentov a integritu mitochondrií. Metylénová modrá sa po odstavení podávala systémovo v pitnej vode v množstve približne 10 mg/kg denne. Mutantné myši, ktoré ju dostávali, si v porovnaní s mutantnými myšami bez podávania zachovali väčšiu hrúbku sietnice, viac markerov rodopsínu a opsínu a zdravšiu štruktúru mitochondrií.

Sprievodná práca s bunkami využívala bunky 661W, imortalizovanú myšiu líniu podobnú fotoreceptorom, vystavenú rotenónu s metylénovou modrou alebo bez nej počas 24 hodín. Prežívanie sa zlepšilo pri koncentrácii 30 mikromolárnych a nižšie koncentrácie normalizovali pomer NADH k NAD+ a znižovali oxidačný stres. Pozoruhodné je to, čo metylénová modrá neurobila: neobnovila ATP. Ochrana súvisela so zmiernením redoxného stresu a utlmením stresových dráh vrátane mitochondriálnej odpovede na nesprávne zložené proteíny a markerov mitofágie, nie s obnovením zásobovania energiou.

Tento rozdiel je dôležitý pri tvrdeniach o metylénovej modrej a sietnici. Látka môže udržať fotoreceptor vystavený stresu pri živote bez toho, aby napravila jeho energetický deficit. Akékoľvek úvahy o liečebnom využití sa tak zužujú na redoxný stres, nie na všeobecné omladenie.

Tri štúdie vedľa seba

Nasledujúce porovnanie uvádza pri každej štúdii model a spôsob podania, pretože práve tieto dva stĺpce určujú, aké závery môže výsledok podporiť.

Každý riadok je predklinický. Žiadna zo štúdií nezahŕňala pacientov, nemerala zrak ani netestovala očný prípravok.

Prečo nejde o liečbu glaukómu

Liečba glaukómu znižuje vnútroočný tlak. Neuroprotekcia sa usiluje o niečo iné: udržať gangliové bunky a ich axóny pri živote v podmienkach stresu. Uvedené štúdie patria k druhému cieľu, nie k prvému. Žiadna z nich neznižovala tlak a žiadna neporovnávala metylénovú modrú s liečbou na zníženie tlaku. Preto zavedené prístupy k liečbe glaukómu a regulácii tlaku zostávajú samostatnou otázkou, odlišnou od redoxnej neuroprotekcie, a výsledok týkajúci sa prežívania buniek nemožno chápať ako zachránený zrak.

Rozdiely v spôsobe podania tento záver posilňujú. Súčasná intravitreálna injekcia umiestni známe množstvo látky vedľa sietnice v okamihu poškodenia. Podávanie v pitnej vode vystavuje látke celé zviera počas mesiacov, pričom koncentrácia v sietnici nie je známa. Kultivačné médium pôsobí priamo na samotné bunky. Žiadny z týchto spôsobov nepredpovedá, aká časť lokálne podanej dávky by prešla cez rohovku, unikla odplaveniu slzami, prešla cez šošovku a sklovec a dostala sa do niektorej vrstvy sietnice v prospešnej koncentrácii. Tento problém dopravenia látky je súčasťou širšej otázky spôsobov podania a distribúcie metylénovej modrej, pri ktorej si každý spôsob podania vyžaduje vlastné merania koncentrácie.

Rozdiely medzi tkanivami predstavujú druhú prekážku. Farbivo, ktoré sa dostane do prednej časti oka, sa tým ešte nedostalo do jeho zadnej časti a koncentrácia, ktorá pomáha jednej vrstve, môže poškodiť inú. Maloobchodné roztoky sa nevyrábajú, nesterilizujú, nepufrujú ani nekonzervujú ako očné prípravky. Pri pôsobení na rohovku a vnútroočné tkanivá pritom záleží na čistote, pH, osmolalite aj pomocných látkach. Nič v týchto zisteniach o sietnici neopodstatňuje aplikáciu takýchto roztokov do oka ani na jeho povrch. Otázky noriem pre prípravky patria do oblasti bezpečnosti a zaobchádzania s metylénovou modrou.

Kde sa dôkazy končia

Pri spoločnom posúdení tieto tri práce podporujú úzko vymedzené tvrdenie: za kontrolovaných podmienok môže metylénová modrá zmierňovať mitochondriálny redoxný stres v neurónoch sietnice a zachovávať ich štruktúru. Tvrdenie sa končí tam, kde sa končia tieto podmienky. Toxínové modely a modely genetickej poruchy komplexu I nie sú glaukóm, drúzy ani diabetické ochorenie. Krátke obdobia pozorovania a štrukturálne ukazovatele nie sú dlhodobo zachovaný zrak. A ochranná koncentrácia v jednom kompartmente nie je dávkou pre iný.

Silnejšie dôkazy by si vyžadovali samostatné podklady: stanovenú expozíciu sietnice po klinicky použiteľnom spôsobe podania, funkčné ukazovatele zraku u zvierat, prínos nezávislý od tlaku v modeli relevantnom pre glaukóm a následne údaje o bezpečnosti a účinnosti u ľudí. Kým nebudú k dispozícii, metylénová modrá v súvislosti so zrakom zostáva výskumnou hypotézou s jasnými hranicami: vierohodné mitochondriálne farmakologické pôsobenie v sietnici, preukázané len v bunkách a u zvierat, bez cesty od týchto štúdií k liečbe očí.