Metylénová modrá, tau a amyloid: prečo sa mechanizmy odstraňovania proteínov líšia

Spýtajte sa, čo metylénová modrá robí s proteínmi pri Alzheimerovej chorobe, a dostanete jednu sebavedomú odpoveď tam, kde by ste mali dostať tri odpovede s jasnými výhradami. V skúmavke narúša vzájomné spájanie tau. V jednom myšacom modeli znižuje rozpustný amyloid, pričom tau necháva nezmenené. V inom obmedzuje enzým, ktorý amyloid vôbec vytvára. Každé z týchto zistení je skutočné. Žiadne však nie je celým príbehom a nie všetky tieto deje prebiehajú v tom istom zvierati v rovnakom čase. Tento článok ich oddeľuje, aby sa výsledok jedného experimentu prestal citovať ako dôkaz iného.

Čitatelia, ktorí chcú širší prehľad o tom, ako metylénová modrá pôsobí v bunkách, by mali začať tam. Tí, ktorí chcú vedieť, či niečo z toho pomohlo pacientom, by si mali prečítať prehľad klinických zistení pri Alzheimerovej chorobe, kam patria výsledky štúdií na ľuďoch. Tento článok tieto zistenia neopakuje.

Zistenie o tau patrí k testom agregácie

Najstarší z troch príbehov pochádza z bezbunkového výskumu tau, proteínu, ktorý vytvára neurofibrilárne klbká. V teste väzby tau-tau sa fragmenty tau skladajú do párových helikálnych filamentov a fenotiazínové farbivá vrátane metylénovej modrej toto skladanie blokujú pri nízkych mikromolárnych koncentráciách. Neskorší biochemický výskum priniesol chemické vysvetlenie: farbivo oxiduje cysteínové zvyšky na tau, čím stabilizuje monomérnu formu a potláča fibrily, ktoré by inak rástli. Uvádzané inhibičné koncentrácie pri agregácii tau sa pohybujú približne od jednociferných hodnôt po nízke desiatky mikromólov na liter, čo je rozsah dôležitý pre všetko, čo nasleduje.

Všimnite si, o aký druh tvrdenia ide. Nehovorí nič o tvorbe tau, fosforylácii tau v živom mozgu ani o odstraňovaní tau. Hovorí, že za definovaných podmienok v skúmavke oxidované farbivo bráni tau vo vzájomnom ukladaní. Je to presný, úzko vymedzený a užitočný výsledok. Problém sa začína, keď sa rozšíri na všeobecné tvrdenie, že metylénová modrá odstraňuje patologické zmeny tau, pretože údaje zo zvierat túto verziu nepodporujú.

Zistenie o proteazóme patrí myšiam 3xTg-AD a oddelilo amyloid od tau

Najjasnejším experimentom s rozdielnymi výsledkami pre jednotlivé ukazovatele je 16-týždňová štúdia s podávaním v potrave u myší nesúcich tri mutácie spojené s Alzheimerovou chorobou. Zvieratá od veku šiestich mesiacov prijímali krmivo obsahujúce metylénovú modrú a výskumníci súčasne merali tri veci: proteazóm, hladiny amyloidu a tau.

Proteazóm sa zmenil. Aktivita podobná chymotrypsínu vzrástla približne o štvrtinu a aktivita podobná trypsínu približne o polovicu, zatiaľ čo tretia katalytická aktivita sa významne nezmenila. Rozpustný amyloid-beta 40 aj 42 klesli približne o štvrtinu. Autori to interpretovali ako zvýšené odstraňovanie, nie zníženú tvorbu, pretože prekurzorový proteín ani fragmenty vznikajúce jeho spracovaním sa nezmenili a učenie a pamäť sa zlepšili pri skúšobnom teste vo vodnom bludisku.

Potom však prišli rozdiely medzi ukazovateľmi. Nerozpustný amyloid sa nezmenil. Farbenie plakov sa nezmenilo. Celkové ľudské tau ani fosfo-tau na treoníne 181 sa nezmenili a nezmenila sa ani nesprávna lokalizácia tau. Nezmenili sa ani mitochondriálne ukazovatele: nebol zistený významný účinok na aktivitu cytochróm-c oxidázy, množstvo proteínu tejto oxidázy ani na ATP. V tomto modeli a pri tomto režime teda metylénová modrá zvýšila dve z troch aktivít proteazómu, znížila rozpustný amyloid, zlepšila behaviorálny ukazovateľ a ponechala ukazovatele tau, nerozpustný amyloid aj testované mitochondriálne ukazovatele nezmenené.

Jedna výhrada tento záver skôr spresňuje, než oslabuje. U týchto myší sa v testovanom veku ešte nevytvorili agregáty tau, takže experiment nemôže ukázať, že metylénová modrá proti klbkám tau neúčinkuje. Ukazuje, že rozpustný amyloid môže klesnúť, zatiaľ čo merané ukazovatele tau sa nemenia. Presne takýto výsledok, pri ktorom sa jeden proteín zmení a druhý nie, táto téma potrebuje. Ak ste sem prišli s presvedčením, že aktivácia proteazómu metylénovou modrou odstraňuje oba charakteristické proteíny súčasne, táto štúdia toto presvedčenie koriguje.

Zistenie o tvorbe amyloidu patrí starším myšiam PSAPP a odporuje predchádzajúcemu mechanizmu

Iná skupina, iný model a opačné vysvetlenie na úrovni predchádzajúcich dejov. V trojmesačnej štúdii s podávaním žalúdočnou sondou u 15-mesačných myší PSAPP denná perorálna dávka 3 mg/kg znížila množstvo plakov v jednotlivých oblastiach mozgu približne o tretinu až polovicu a znížila viaceré frakcie amyloidu vrátane oligomérov meraných špecializovaným testom. Tu však navrhovaným mechanizmom bola znížená tvorba, nie rýchlejšie odstraňovanie: množstvo proteínu BACE1 v mozgu kleslo, jeho produkt C99 klesol, no mediátorová RNA nie. To poukazuje na účinok na úrovni proteínu, nie na zníženie génovej expresie.

Práca s bunkami toto vysvetlenie podporila. V bezbunkovom teste s rekombinantným enzýmom metylénová modrá priamo inhibovala BACE1 a v bunkách vaječníkov škrečka exprimujúcich ľudský prekurzorový proteín amyloidu kleslo množstvo vylučovaného amyloidu 40 a 42 už pri koncentráciách 1.56 mikromólu na liter, zatiaľ čo samotný prekurzor sa nezmenil. Porovnajte to s predchádzajúcou štúdiou, v ktorej sa fragmenty vznikajúce spracovaním prekurzora nezmenili a účinok sa pripísal odstraňovaniu. Obe nemôžu opisovať ten istý univerzálny mechanizmus, pretože modely, vek, dávky, spôsoby podávania aj trvanie sa líšia. Práve o to ide. Účinky metylénovej modrej na amyloid sa v jednom usporiadaní sprostredkúvajú cez tvorbu a v inom cez odstraňovanie; citovať ktorýkoľvek z nich bez príslušného kontextu je zavádzajúce.

Jedna chémia, viacero cieľov: prepojenie cez oxidáciu cysteínu

Tretia línia výskumu vysvetľuje, ako sa tá istá redoxná chémia môže prejaviť v nesúvisiacich príbehoch o proteínoch. V biochemickej štúdii inhibície kaspáz metylénová modrá inaktivovala kaspázu-6 oxidáciou jej katalytického cysteínu na kyselinu sulfénovú, čo potvrdila hmotnostná spektrometria, pri koncentrácii vyvolávajúcej polovicu maximálneho účinku približne 10.6 mikromólu na liter. Kaspáza-3 bola inhibovaná pri podobnej koncentrácii. Autori to výslovne spojili s literatúrou o tau: tá istá chémia oxidácie cysteínu, ktorá má podľa navrhovaného mechanizmu udržiavať tau v monomérnej forme, môže vyradiť cysteínovú proteázu, pričom účinné koncentrácie sa prekrývajú.

Je to elegantné a zároveň varovné. Redoxne aktívna molekula, ktorá oxiduje prístupné cysteíny, bude mať pri akejkoľvek účinnej koncentrácii viac než jeden cieľ. Príbeh o rozrušovaní agregátov tau, príbeh o kaspázach a možno aj ďalšie majú spoločné chemické sloveso, ale odlišné podstatné mená. Toto spoločné sloveso nerobí zistenia zameniteľnými. Znamená to, že dávka a kontext rozhodujú, ktorý cieľ je dôležitý, a že dlhodobé podávanie zamerané na jeden proces závislý od cysteínu môže zasiahnuť aj ďalšie. Autori štúdie o kaspázach na túto okolnosť priamo upozornili. Súvisiace otázky o tom, ako si redoxná chémia metylénovej modrej vyberá svoje ciele, čo aktivácia proteazómu znamená pre iné agregované proteíny a či dlhodobé podávanie mení profil cieľov, si každá zaslúžia samostatné spracovanie.

Mechanizmus podľa sledovaného ukazovateľa: ktoré zistenie patrí ku ktorému modelu

Čítajte tabuľku riadok po riadku a poučenie je jasné. Ani jeden riadok sa nemení v každom stĺpci. Najsilnejší výsledok týkajúci sa tvorby amyloidu pochádza zo štúdie, ktorá proteazóm vôbec netestovala. Najsilnejší výsledok týkajúci sa proteazómu pochádza zo štúdie, v ktorej sa spracovanie prekurzora vôbec nezmenilo. Výsledok týkajúci sa tau pochádza prevažne zo skúmaviek a z chémie spoločnej aj pre enzýmy mimo zamýšľaného cieľa. Každý, kto tieto stĺpce zlúči do jediného tvrdenia, že metylénová modrá odstraňuje patologické proteíny ako celú triedu, píše prehľad experimentu, ktorý sa nikdy neuskutočnil.

Táto dôslednosť platí aj pri pacientoch. To, či tieto mechanizmy spoločne prinášajú klinický prínos, je samostatná otázka s vlastnými štúdiami a vlastnými závermi. Odpoveď patrí do klinických dôkazov pri Alzheimerovej chorobe, nie sem.