Metylénová modrá a skleróza multiplex: čo skúmal výskum na zvieratách

Keď vyhľadáte metylénovú modrú pri SM, nájdete práce, ktoré zdanlivo odpovedajú na rovnakú otázku. Nie je to tak. Jedna práca podávala metylénovú modrú chorým myšiam ako liečbu. Druhá ňou neliečila žiadne zviera. Používala metylénovú modrú ako modré farbivo na tenkých rezoch miechy, aby patológ mohol pod mikroskopom vidieť myelín.

Na tomto rozlíšení stojí celý článok. Farbivo má v biológii dve úlohy, ktoré okrem fľaštičky nemajú nič spoločné. Ako potenciálny liek sa podáva živému zvieraťu a otázkou je, či sa ochorenie zmení. Ako farbivo sa po experimente nanáša na odumreté, fixované tkanivo a otázkou je, ako tkanivo vyzeralo. Ak vám tento rozdiel unikne, budete časť o patologických metódach čítať, akoby opisovala výsledok liečby.

Čo je EAE, jednoducho povedané

Experimentálna autoimunitná encefalomyelitída, zvyčajne skrátene EAE, je štandardný zvierací model niektorých aspektov sklerózy multiplex. Výskumník imunizuje vnímavú myš fragmentom myelínového proteínu spolu so silným adjuvans. Imunitný systém potom napadne vlastný centrálny nervový systém zvieraťa. U myši sa rozvinie vzostupná slabosť, ktorú možno ľahko hodnotiť na stupnici od 0 do 5, od ochabnutého chvosta až po paralýzu zadných končatín.

Práve jednoduchosť tohto hodnotenia vysvetľuje, prečo je EAE obľúbená, ale aj prečo môže zavádzať. Ľudská SM vzniká spontánne, zahŕňa širší a menej presne vymedzený súbor cieľov a spôsobuje zrakové, senzorické, kognitívne, mozočkové a motorické príznaky pri relapsujúcom alebo progresívnom priebehu. EAE reprodukuje vybrané mechanizmy, ako sú zápal, demyelinizácia a poškodenie axónov, v kontrolovaných podmienkach. Nie je zmenšenou verziou SM. Čitatelia, ktorí chcú pochopiť všeobecný rámec, sa môžu pred posudzovaním jednotlivých tvrdení o ochoreniach oboznámiť s tým, ako má podľa súčasných predstáv metylénová modrá pôsobiť na bunkovej úrovni.

Aj dve nižšie uvedené práce používali odlišné antigény na vyvolanie EAE, čo je dôležité. Štúdia liečby vyvolala ochorenie pomocou MOG35-55, krátkeho peptidu z myelínového oligodendrocytového glykoproteínu. Patologická štúdia vyvolala ochorenie pomocou MP4, fúzie segmentov myelínového bázického proteínu a proteolipidového proteínu. Výber kmeňa a antigénu mení miesto výskytu lézií aj správanie zápalu, takže tieto dve štúdie nie sú dvoma opakovaniami jedného experimentu.

Prehľad: od modelu cez otázku po limity

Majte túto tabuľku poruke. Je základným referenčným prehľadom tohto článku. Každý riadok uvádza, na ktorú klinickú otázku môže model odpovedať, čo sa skutočne meralo a kde sa možnosti prenosu výsledkov končia.

Každý, kto si overuje ďalší titulok, môže použiť rovnaké stĺpce s pomocou článku o tom, ako čítať predklinické štúdie: pýtajte sa na druh zvieraťa a antigén, úlohu zlúčeniny, sledované ukazovatele a na to, či výsledok opisuje priebeh ochorenia alebo okamžitý stav tkaniva.

Výsledok liečby: čo zmenilo podávanie

Štúdia liečby z roku 2016 v časopise Journal of Neuroimmunology používala samice myší C57BL/6 vo veku približne 8 až 10 týždňov, imunizované 250 mikrogramami MOG35-55 na myš. Po vyvolaní EAE boli zvieratá náhodne rozdelené do skupiny s metylénovou modrou alebo do neliečenej skupiny s EAE a klinické skóre sa sledovalo približne do 30. dňa.

Klinické skóre bolo u liečených myší od 15. do 30. dňa významne nižšie než u kontrolných myší s EAE, pri P menšom ako 0.01. Analýza miechy ukázala rovnaký smer výsledkov: u liečených zvierat bola menšia zápalová infiltrácia, menšia demyelinizácia a menší úbytok axónov.

Osobitnou časťou bolo sledovanie súboru signalizačných ukazovateľov. Liečba zvýšila aktiváciu AMPK a expresiu SIRT1 a potlačila aktiváciu NF-kB, ústredného regulátora zápalu. V rámci adaptívnej imunity znížila odpoveď Th17 a posilnila odpoveď Treg. Navrhovaná postupnosť teda vedie od metylénovej modrej cez AMPK a SIRT1 k nižšej signalizácii NF-kB, následne k posunu od zápalových Th17 k regulačným Treg, k miernejšiemu poškodeniu tkaniva a napokon k nižšiemu skóre.

Táto postupnosť je interpretáciou, nie preukázaným príčinným reťazcom. Štúdia ukazuje, že podávanie lieku, zmeny signalizácie a zlepšenie ochorenia sa vyskytovali spoločne. Nedokazuje, že AMPK a SIRT1 sprostredkúvajú celý prínos, a verejne indexovaný text neuvádza presnú dávku v miligramoch na kilogram, spôsob podania, deň začatia ani trvanie dostatočne jasne na to, aby sa režim dal zopakovať iba podľa abstraktu. Akékoľvek číselné údaje o dávkovaní citované z tejto práce na predajnej stránke považujte za neoverené, pokiaľ neodkazujú na metódy v plnom texte. V širšom súbore dôkazov o metylénovej modrej u ľudí treba overiť, či tento skorý imunitný signál niekedy viedol ku klinickým údajom.

Patologický výsledok: čo ukázalo tkanivo počas šiestich mesiacov

Štúdia MP4 z roku 2015 v časopise PLoS ONE používala samice myší C57BL/6 imunizované 200 mikrogramami MP4 v kompletnom Freundovom adjuvans spolu s pertusovým toxínom v deň imunizácie a znova o 48 hodín neskôr. Žiadne zviera nedostalo metylénovú modrú ako liek. Po fixácii a zaliatí sa priečne rezy miechy s hrúbkou jeden mikrometer farbili metylénovou modrou na svetelnú mikroskopiu; jemnejšie detaily sa skúmali elektrónovou mikroskopiou ventrolaterálneho traktu.

Tkanivo sa odoberalo v troch štádiách: na akútnom vrchole u 7 myší, tri mesiace po nástupe u 5 myší a šesť mesiacov po nástupe u 10 myší. Priemerné klinické skóre v týchto štádiách vyzeralo takmer rovnako, približne 1.7 až 1.8 na stupnici od 0 do 5. Tkanivo však ukázalo iný obraz. Izolované poškodenie myelínu vzrástlo z približne 569,000 vlákien na štvorcový milimeter na akútnom vrchole na približne 1,496,000 po šiestich mesiacoch, pričom porovnanie akútneho a dlhodobého štádia bolo významné pri P rovnom 0.027. Kombinované poškodenie myelínu aj axónov sa do šiestich mesiacov približne zdvojnásobilo. Podiel remyelinizujúcich vlákien zostal v každom štádiu pod jedným percentom, čo je triezvy údaj pre nádeje na obnovu.

Poškodenie axónov malo priebeh v tvare U: bolo vysoké na akútnom vrchole, nižšie po troch mesiacoch a najvyššie po šiestich mesiacoch. Korelovalo s opuchom mitochondrií a so zmenšenými rozostupmi medzi neurofilamentmi. Hodnotenie prebiehalo bez znalosti skóre a štádia, čo posilňuje záver, že klinické skóre nezachytávalo plný rozsah pokračujúceho štrukturálneho poškodenia.

Práve tento nesúlad je skutočným prínosom štúdie pre čitateľa zaujímajúceho sa o SM. Stabilné skóre zdravotného postihnutia neznamenalo stabilný stav tkaniva. Zároveň ukazuje, prečo táto práca nemôže podporiť žiadne tvrdenie o liečbe SM metylénovou modrou. Skúmala čas, nie liečbu.

Prečo ani jedna štúdia nepreukazuje prínos u pacientov

Každú prácu vnímajte tak, že dobre odpovedá na úzku otázku, ale vôbec neodpovedá na otázku týkajúcu sa pacientov.

Po prvé, príčina je odlišná. EAE sa vyvoláva zámerne pomocou definovaného antigénu a adjuvans. Ľudská SM sa vyvíja spontánne so širším imunitným repertoárom, ktorý zahŕňa T bunky, B bunky, vrodenú imunitu a rezidentné gliové bunky. Zlúčenina, ktorá u myši mení odpoveď zameranú na MOG, nemusí meniť túto širšiu odpoveď u človeka.

Po druhé, fenotyp je odlišný. Vzostupná slabosť postupujúca od chvosta k zadným končatinám myši je praktickým ukazovateľom. Rôznorodosť ľudskej SM zhusťuje do jedného čísla opisujúceho motoriku. Lieky bežne menia krátkodobé skóre EAE bez toho, aby menili priebeh ochorenia u ľudí. Preto je EAE nástrojom na skríning a skúmanie mechanizmov, nie zmenšenou klinikou.

Po tretie, expozícia a načasovanie zostávajú nevyriešené. Sústavné podávanie od skorého štádia v 30-dňovom experimente na myšiach nie je to isté ako chronické perorálne užívanie u človeka s už rozvinutým ochorením a ani jedna štúdia nemerala hladiny lieku v nervovom systéme. Bez tohto prepojenia nemožno premostiť koncentráciu na laboratórnej platni alebo dávku u myši na režim podávania u človeka.

Po štvrté, tieto dve práce sa navzájom nereplikujú. Majú odlišné antigény, odlišné otázky, odlišné sledované ukazovatele a v jednom prípade nejde vôbec o liečbu. Citovať ich spoločne ako dve pozitívne štúdie liečby SM znamená zamieňať kategórie.

Čo to znamená pre čitateľov, ktorí zvažujú dôkazy

V týchto prácach nie je žiadny zavedený protokol používania metylénovej modrej pri SM. Štúdia liečby podporuje ďalší výskum AMPK, SIRT1, NF-kB a rovnováhy medzi Th17 a Treg pri MOG EAE. Patologická štúdia pripomína, že poškodenie tkaniva môže postupovať aj vtedy, keď sa skóre nemení, a že metylénová modrá v časti o metódach niekedy znamená nádobu s farbivom, nie liek v lekárničke. Čitatelia sledujúci prebiehajúci výskum sklerózy multiplex by mali mať na pamäti tento rozdiel medzi farbivom a liekom. Otázky bezpečnosti vrátane rizík pre krv a rizík interakcií patria do rozhovoru s lekárom spolu so všeobecnými údajmi o bezpečnosti metylénovej modrej, skôr než sa niekto začne riadiť titulkami o laboratórnych výsledkoch.

Záver sa zmestí do jednej vety. Jedna citovaná štúdia podávala metylénovú modrú myšiam s MOG EAE a zaznamenala miernejšie ochorenie spolu s protizápalovým posunom imunitnej odpovede, zatiaľ čo druhá citovaná štúdia nepodávala nič a používala metylénovú modrú iba na farbenie miechy pri dokumentovaní šiestich mesiacov hromadiaceho sa poškodenia myelínu a axónov, takže táto dvojica štúdií nepreukazuje, že metylénová modrá pomáha pri ľudskej SM.