Dokáže metylénová modrá obísť mitochondriálny komplex III? Prečo sa štúdie nezhodujú

Dve laboratóriá skúmali, či metylénová modrá dokáže obísť zablokovaný mitochondriálny komplex III. Jedno odpovedalo nie. Druhé odpovedalo áno. Obe mali údaje.

Prvá štúdia na mitochondriách z myšieho mozgu zistila, že farbivo to nedokáže. Druhá, na mozgových mitochondriách troch druhov hlodavcov, zistila, že to čiastočne dokáže. Tretia štúdia na myšej pečeni sa v tejto súvislosti často cituje, no skúmala niečo iné. Ak ju zaradíme tam, kam patrí, polovica nejasností sa vytratí.

Nemožno tu vyhlásiť jeden univerzálny mechanizmus. Máme tri experimenty s rôznymi blokátormi, dávkami a meranými ukazovateľmi. Najprv si prečítajte podmienky. Z nich vyplývajú závery.

Čo tu znamená obídenie

Elektróny vstupujú do reťazca cez komplex I (z NADH) alebo komplex II (zo sukcinátu), prechádzajú cez komplex III na cytochróm c a potom cez komplex IV ku kyslíku. Gradient vytvorený počas tohto procesu bunka využíva na tvorbu ATP.

Tvrdenie o obídení znamená, že metylénová modrá prijíma elektróny pred miestom blokády a odovzdáva ich za ním. Oxidované farbivo prijíma elektróny z NADH alebo zo skorších zložiek reťazca, čím sa mení na leukometylénovú modrú, a redukovaná forma ich odovzdáva cytochrómu c alebo späť do reťazca. Ak ich odovzdá za miestom blokády, respirácia a membránový potenciál sa čiastočne obnovia. Ak ich odovzdá v mieste blokády alebo pred ním, nič sa neobnoví.

Veľkú časť tohto sporu rozhoduje jeden detail komplexu III. Komplex uskutočňuje Q-cyklus s dvoma miestami väzby inhibítorov. Antimycín sa viaže na miesto Qi. Myxotiazol sa viaže na miesto Qo. Štúdia, ktorá používa iba jeden z nich, skúma len polovicu komplexu.

Prvá štúdia: žiadne obídenie v mitochondriách z myšieho mozgu

Gureev a kolegovia použili mitochondrie z mozgovej kôry myší C57BL/6, izolované digitonínom, a merali pri koncentrácii proteínu 0.1 mg na ml. Substráty zahŕňali tri režimy: pyruvát s malátom, každý v koncentrácii 5 mM, sukcinát v koncentrácii 10 mM s glutamátom v koncentrácii 2 mM a L-prolín v koncentrácii 10 mM. Blokátormi boli rotenón v 1 mikromolárnej koncentrácii (komplex I) a antimycín v koncentrácii 1 mikrogram na ml (komplex III). Dávky farbiva zodpovedali koncentráciám 0.5, 1 a 2 mikromolárne, pričom hlavnou koncentráciou bola 1 mikromolárna. Metódy a záznamy meraní sú v krátkom článku v časopise FEBS Letters.

Obídenie komplexu I fungovalo. Rotenón znížil respiráciu stimulovanú ADP z približne 121 na približne 2 nmol za minútu na mg a farbivo v 1 mikromolárnej koncentrácii ju obnovilo na približne 21. Membránový potenciál sa obnovil pri pyruváte s malátom aj pri L-prolíne.

Obídenie komplexu III nefungovalo. Antimycín znížil respiráciu na približne 16 a farbivo ju zvýšilo len na približne 20. Membránový potenciál sa neobnovil pri žiadnom substráte ani pri koncentráciách farbiva až do 5 mikromolárnych. Údaje o peroxide ukazovali rovnakým smerom: samotné farbivo zvýšilo uvoľňovanie peroxidu z bazálnej rýchlosti približne 76 pmol za minútu na mg na približne 1170, 1460 a 1945 pri troch dávkach, no antimycín tento signál vyvolaný farbivom znížil približne o 25, 88 a 96 percent. Ak by redukované farbivo reagovalo priamo s kyslíkom, blokovanie komplexu III by signál nemalo potláčať. Autori z toho vyvodili, že redukované farbivo sa oxiduje na mieste Qo komplexu III, pred miestom blokády antimycínom. Krátka slučka slovami: z donorov na farbivo, z farbiva na Qo a ďalej bežnou cestou. Rotenón sa obíde. Antimycín nie.

Druhá štúdia: čiastočné obídenie pri troch druhoch, na oboch miestach väzby inhibítorov

Svab a kolegovia rozšírili experimentálny návrh. Použili mozgové mitochondrie myší, potkanov a morčiat, izolované pomocou Percollu, a merali pri rovnakej koncentrácii 0.1 mg na ml, s pyruvátom a malátom alebo glutamátom a malátom, každý v koncentrácii 5 mM. Použili dva blokátory komplexu III: antimycín A v 0.3 mikromolárnej koncentrácii a myxotiazol v 1 mikromolárnej koncentrácii. Farbivo malo vo väčšine meraní 2 mikromolárnu koncentráciu, pri pokusoch s cytochrómom c 0.5 mikromolárnu. Všetky tri druhy skúmané podľa zhodných protokolov sú opísané v článku s otvoreným prístupom.

Obe blokády sa čiastočne obišli pri všetkých troch druhoch. V myších mitochondriách antimycín potlačil respiráciu a farbivo ju zvýšilo približne o 60 percent, z približne 37 na 59 nmol za minútu na mg. Myxotiazol ju potlačil o 88 percent, na približne 4.5, a farbivo ju zvýšilo päťnásobne na približne 23. Pri oboch inhibítoroch sa membránový potenciál čiastočne obnovil. Merali ho dvoma farbivami (safranín O a pomerometrické TMRM), aby vylúčili optické artefakty.

Táto práca priamo skúmala aj odovzdávanie elektrónov, čo prvá štúdia vôbec nerobila. Exogénny acetylovaný cytochróm c v 25 mikromolárnej koncentrácii sa mitochondriami v energizovanom stave neredukoval, či už s inhibítormi, alebo bez nich, no pridanie farbiva vyvolalo redukciu v oboch prípadoch. V bezbunkovom pufri NADH s farbivom redukovali cytochróm c rýchlosťou úmernou NADH. Dlhší preskok slovami: redukčné ekvivalenty na farbivo, z farbiva priamo na cytochróm c, cez komplex IV ku kyslíku. Táto cesta úplne vynecháva komplex III, takže možno obísť oba blokátory.

Tento výklad podporujú dva ďalšie merané ukazovatele. Fluorescencia NAD(P)H po pridaní farbiva k mitochondriám ošetreným myxotiazolom klesla, čo znamená, že redukčné ekvivalenty odchádzali novou cestou. Absorbancia farbiva pri 660 nm zachytávala každý postupný prídavok, zatiaľ čo supernatanty po centrifugácii ukázali, že oxidované farbivo sa vo vnútri mitochondrií v energizovanom stave koncentrovalo viac než stonásobne a po zrútení potenciálu ich opúšťalo. Zodpovedá tomu aj protónová bilancia: vynechanie krokov čerpania ponecháva približne 2 protóny na pár elektrónov namiesto 10, takže rýchlejšia spotreba kyslíka s iba čiastočnou repolarizáciou zodpovedá skutočnému obídeniu a nie je dôkazom proti nemu.

Tá istá preparácia poskytla aj odpovede, ktoré sa pri povrchnom čítaní ľahko nesprávne vyložia. Pri inhibítore s farbivom ADP respiráciu znižovalo namiesto toho, aby ju zvyšovalo, a blokáda transportu ju stimulovala namiesto toho, aby ju spomaľovala, zatiaľ čo membránový potenciál sa stále menil bežnými smermi. Samotná spotreba kyslíka je v tomto systéme zavádzajúca.

Tretia štúdia: pečeňová štúdia, ktorá skúmala komplexy I a II, nie III

Lee a Boelsterli použili mitochondrie z myšej pečene a kultivované hepatocyty poškodené efavirenzom (komplex I, IC50 približne 30 mikromolárna) a hydrazínom, metabolitom izoniazidu (komplex II, IC50 približne 30 mikromolárna). Farbivo v približne 30 mikromolárnej koncentrácii obnovilo oxidáciu NADH, membránový potenciál a ATP, pričom znížilo množstvo oxidantov a nekrotické odumieranie. Článok v časopise Redox Biology tento proces modeluje ako prenos elektrónov farbivom obchádzajúci poškodené komplexy I a II.

Tento výsledok predstavuje potvrdený kontext pre skoršiu časť reťazca a o komplexe III nič nehovorí, pretože v ňom nebolo nič zablokované. Nemôže potvrdiť ani vyvrátiť žiadnu z mozgových štúdií.

Matica podmienok

Štyri dôvody, prečo môžu mať obe štúdie komplexu III vo svojich podmienkach pravdu

1. Blokátor nepredstavoval rovnaký zásah. Samotný antimycín v koncentrácii 1 mikrogram na ml oproti antimycínu v 0.3 mikromolárnej koncentrácii a samostatnému blokátoru miesta Qo. Cesta, ktorou farbivo privádza elektróny na miesto Qo, zlyháva presne tam, kde priama cesta na cytochróm c uspeje. Jedno miesto nemôže zastupovať obe.

2. Dávka farbiva a časovanie sa líšili. Hlavné koncentrácie boli 1 oproti 2 mikromolárnym pri látke podliehajúcej redoxnému cyklovaniu, ktorej príjem a priama redukcia cytochrómu c závisia od koncentrácie a času. Malé rozdiely v dávke spolu s odlišným časovaním merania môžu odhaliť rôzne vetvy jednej siete.

3. Preparácie sa líšili. Izolácia digitonínom oproti izolácii v gradiente Percollu vyberá prekrývajúce sa, ale nie totožné populácie mitochondrií. Koncentrácia proteínu bola zhodná, 0.1 mg na ml, takže táto premenná odpadá, no subpopulácia a integrita nie. A podozrenie na vplyv druhu sa vyvrátilo: druhá skupina reprodukovala svoj fenotyp aj u myši.

4. Substrátové podmienky určujú, čo farbivo dokáže. Tri substrátové režimy oproti dvojiciam naviazaným na NADH. Prísun NADH a membránový potenciál spoločne určujú, ako rýchlo sa farbivo redukuje a ako sa distribuuje. Cesta, ktorá potrebuje redukované farbivo v blízkosti oxidovaného cytochrómu c, od tejto voľby závisí.

Ako čítať ďalšie tvrdenie o obídení

Pýtajte sa, ktorý komplex bol zablokovaný, akým inhibítorom, na ktorom mieste a pri akej dávke. Pýtajte sa na koncentráciu farbiva a na to, kedy sa meranie uskutočnilo. Pýtajte sa na tkanivo, druh, izoláciu, koncentráciu proteínu a substrát. A pýtajte sa, či sa zhodujú výsledky meraní potenciálu, respirácie, redoxného stavu a priameho odovzdávania elektrónov, pretože samotná spotreba kyslíka tu viac než raz ukazovala nesprávnym smerom.

Úzko vymedzené zhrnutie platí. Na obídení komplexu I farbivom panuje zhoda. Pri komplexe III myšie mitochondrie s antimycínom v koncentrácii 1 mikrogram na ml a farbivom v 1 mikromolárnej koncentrácii nevykazujú funkčné obídenie, zatiaľ čo tri druhy s antimycínom v 0.3 mikromolárnej koncentrácii alebo myxotiazolom v 1 mikromolárnej koncentrácii a farbivom v 2 mikromolárnej koncentrácii vykazujú čiastočné obídenie s priamym prenosom elektrónov z farbiva na cytochróm c. Tieto tvrdenia môžu platiť súčasne. Čokoľvek širšie je extrapolácia.

Súvisiace čítanie zasadzuje sporné tvrdenie do rámca nespornej chémie: ako metylénová modrá prenáša elektróny vysvetľuje prenos, experimenty s obídením komplexu I opisujú potvrdený prípad v skoršej časti reťazca, merania membránového potenciálu a ich artefakty objasňujú, prečo boli potrebné dve farbivá, a laboratórna práca s látkami podliehajúcimi redoxnému cyklovaniu vysvetľuje úskalia dávkovania a časovania.