Metylénová modrá a ferroptóza: mechanizmus peroxidácie lipidov

Ferroptóza je bunková smrť spôsobená poškodením membrány. Polynenasýtené tuky v membránach oxidujú v reťazovej reakcii, membrána prestane fungovať a bunka zomrie. Táto chemická reakcia vyžaduje železo. V tejto vete je obsiahnutý celý koncept a všetko v tomto článku skúma niektorú jeho časť.

Otázka je tu užšia: čo metylénová modrá robí s týmto reťazcom v bunkových experimentoch a čo tento výsledok skutočne ukazuje. Stručná odpoveď znie, že v dvoch laboratórnych štúdiách metylénová modrá v nanomolárnych koncentráciách znížila peroxidáciu mitochondriálnych lipidov a udržala bunky nažive po pôsobení spúšťačov, ktoré inak vyvolávajú ferroptózu. Podrobnejšia odpoveď je dôležitejšia, pretože každý článok reťazca sa skúmal iným zásahom a každý zásah má svoje obmedzenia.

Ferroptóza v jednom odseku

Membránový fosfolipid s reťazcom polynenasýtenej mastnej kyseliny má slabé miesto: atómy vodíka, ktoré sa dajú ľahko odobrať. Keď radikál jeden z nich odoberie, na lipid sa naviaže kyslík, vznikne lipidový peroxylový radikál a ten odoberie vodík ďalšiemu lipidu. Reakcia sa šíri pozdĺž membrány, pokiaľ ju niečo nezastaví.

Hlavnou brzdou je enzým GPX4, ktorý pomocou glutatiónu redukuje lipidové peroxidy na neškodné lipidové alkoholy. Laboratórne spúšťače napádajú túto obranu na presne určených miestach. Erastín blokuje príjem cystínu cez systém xc-minus, čím bunku pripravuje o cysteín potrebný na syntézu glutatiónu. Butionínsulfoximín blokuje syntézu glutatiónu priamo. RSL3 inhibuje samotný GPX4. Všetky tri ponechávajú peroxidy neodstránené, ale pôsobia v rôznych krokoch, takže výsledok s jedným spúšťačom nemožno automaticky zovšeobecniť na ostatné.

Ferroptóza sa od apoptózy líši vlastnosťami, ktoré ju definujú. Nezahŕňa kaspázovú kaskádu ani apoptotické telieska. Chelátory železa, ako je deferoxamín, a látky zachytávajúce radikály, ako je ferrostatín-1, ju potláčajú. Práve tento praktický test výskumníci používajú na označenie bunkovej smrti za ferroptotickú, a nie iba nekrotickú. Širší prehľad dráh regulovanej bunkovej smrti zasadzuje toto rozlíšenie do kontextu a spôsob, akým bunky nakladajú s labilným železom, vysvetľuje, prečo je chelatácia takou rozhodujúcou kontrolou.

Úloha mitochondrií a prečo bola predmetom sporu

Prvé práce uvádzali, že ferroptóze podliehajú aj bunky bez mitochondriálnej DNA, čo naznačovalo, že mitochondrie nie sú nevyhnutné. Neskoršie práce zistili, že zníženie množstva mitochondrií alebo blokovanie respirácie môže potlačiť ferroptózu spôsobenú nedostatkom cysteínu, nie však priamou inhibíciou GPX4. Oba výsledky môžu byť pravdivé, ak príspevok mitochondrií závisí od spúšťača, typu bunky a miesta, kde dochádza k rozhodujúcej peroxidácii.

Štúdia, na ktorej je tento článok založený, pristúpila k tomuto sporu pomocou sondy špecifickej pre konkrétny bunkový kompartment. MitoCLox je verzia indikátora peroxidácie lipidov cielená na mitochondrie: pri kontakte s lipidovými peroxylovými radikálmi vnútri mitochondrií mení fluorescenciu. Vo fibroblastoch ošetrených erastínom sa oxidácia mitochondriálnej sondy objavila ešte v živých bunkách pred ich smrťou a v rámci populácie bola nerovnomerná. Toto načasovanie je dôležité. Peroxidácia, ktorá predchádza smrti, je možnou príčinou. Peroxidácia nameraná iba v mŕtvych bunkách je pozostatkom poškodenia. Sprievodný prehľad metód merania peroxidácie lipidov a toho, čo jednotlivé sondy zaznamenávajú vysvetľuje, prečo umiestnenie sondy určuje význam signálu.

Rovnaký vzorec sa objavil aj v druhom modeli. Fibroblasty pacienta s Leberovou hereditárnou optickou neuropatiou, ktoré nesú mutáciu komplexu I a majú vyššiu východiskovú úroveň oxidačného stresu, po vyčerpaní glutatiónu zomierali ferroptózou, zatiaľ čo kontrolné fibroblasty odolávali. Oxidácia mitochondriálnej sondy opäť nastala ako prvá. Podrobnosti sú v štúdii mitochondriálnej peroxidácie lipidov pri ferroptóze vo fibroblastoch.

Čo metylénová modrá zmenila v týchto experimentoch

Metylénová modrá je redoxný prenášač. Jej oxidovaná forma prijíma elektróny z reakcií súvisiacich s NADH v komplexe I a jej redukovaná forma ich odovzdáva cytochrómu c, ktorý ich prenáša do komplexu IV. Vzniká tým čiastočné obídenie úseku reťazca, v ktorom elektróny bežne unikajú na kyslík za vzniku superoxidu. Čitatelia, ktorí chcú úplný obraz tohto prenosu, by mali začať článkom o tom, ako metylénová modrá prenáša elektróny cez mitochondrie.

V pľúcnych fibroblastoch ošetrených erastínom metylénová modrá pri koncentrácii 250 nanomolov na liter zachovala životaschopnosť v teste prežívania buniek, podobne ako antioxidanty SkQ1 a MitoTEMPO cielené na mitochondrie. Kontroly vymedzujú, čo možno z výsledku vyvodiť. Ochranu poskytli aj ferrostatín-1, alfa-tokoferol a deferoxamín, čo potvrdzuje, že išlo o ferroptotickú smrť. Analóg SkQ1 bez antioxidačnej skupiny ochranu neposkytol, čo poukazuje na redoxné reakcie, a nie na nešpecifické hromadenie látky. Ochrana slabla pri koncentráciách SkQ1 nad približne 200 nanomolov na liter, čo zodpovedá známemu prooxidačnému správaniu chinónových antioxidantov pri vyššej záťaži. Metylénová modrá vykazuje rovnaké dvojité správanie závislé od dávky: v týchto kultivačných miskách pôsobí pri nízkych nanomolárnych koncentráciách ochranne, no pri vyšších koncentráciách alebo silnom osvetlení môže redoxným cyklovaním vytvárať peroxid vodíka. Takémuto kontextu dávky sa venuje článok o reaktívnych formách kyslíka v mitochondriách.

Experimenty s izolovanými mitochondriami potom oddelili jednotlivé zdroje ROS. V prítomnosti dvojmocného železa stimulovali oxidáciu sondy substráty dodávajúce elektróny komplexu I spolu s rotenónom. Rotenón blokuje prenos za flavínovým miestom, takže predchádzajúce prenášače zostávajú redukované a z flavínu orientovaného do matrix unikajú elektróny na kyslík. Substráty dodávajúce elektróny komplexu III spolu s antimycínom A vytvárali veľké množstvo peroxidu vodíka, ale nevyvolávali peroxidáciu lipidov. Rovnaký celkový signál ROS, iné miesto, iný výsledok. SkQ1 aj metylénová modrá potláčali peroxidáciu vyvolanú komplexom I bez toho, aby potláčali samotnú tvorbu peroxidu vodíka. To umiestňuje ich pôsobenie až za vznik ROS, do kroku peroxidácie lipidov.

Vetva s preťažením železom a stopa v podobe lipofuscínu

Druhá štúdia skúmala otázku zo strany železa. V kardiomyocytoch H9c2 vystavených submilimolárnym koncentráciám citrátu železito-amónneho vznikali mitochondriálne ROS, nasledovala peroxidácia mitochondriálnych lipidov, potom ferroptóza a následne nahromadenie pigmentu podobného lipofuscínu v priebehu 24 hodín. Lipofuscín je autofluorescenčný zvyšok oxidovaných lipidov a bielkovín obsahujúci železo, ktorý sa hromadí s vekom. Jeho rýchly vznik tu prepája akútnu peroxidáciu vyvolanú železom s klasickým markerom starnutia. Metylénová modrá v nanomolárnych koncentráciách aj SkQ1 zabránili peroxidácii, bunkovej smrti a hromadeniu pigmentu. Izolované srdcové mitochondrie potvrdili tento vzorec: rotenón spolu s dvojmocným železom vyvolávali peroxidáciu a signál podobný pigmentu, pričom obe látky tento proces blokovali. Celá postupnosť je opísaná v štúdii preťaženia železom v kardiomyocytoch H9c2. Pigmentová časť tohto príbehu súvisí s témou lipofuscínu a markerov bunkového starnutia.

Čo testy prežívania buniek neukazujú

Test životaschopnosti, ako je CellTiterBlue, ukazuje, koľko buniek v kultivačnej miske zostáva metabolicky aktívnych po pôsobení spúšťača a skúmanej ochrannej látky. Ide o skúšku mechanizmu v definovanom systéme. Nie je to výsledok liečby. V žiadnom z týchto experimentov sa látka nepodávala pacientovi, nemeral sa výsledok súvisiaci s ochorením ani sa nestanovilo terapeutické okno v organizme.

Štyri obmedzenia treba uviesť výslovne. Po prvé, rozsah bunkových typov je úzky: transformované pľúcne fibroblasty, primárne kožné fibroblasty vrátane jednej línie s mitochondriálnym ochorením, potkania línia kardiomyocytov a izolované mitochondrie potkanieho srdca. Citlivosť sa medzi líniami líšila a línia LHON bola zámerne zvolená pre svoju nezvyčajnú zraniteľnosť. Po druhé, spúšťače predstavujú laboratórne extrémy: úplnú blokádu transportu alebo syntézy a záťaž železom, ktorej by žiadne tkanivo nebolo akútne vystavené. Po tretie, koncentráciu nemožno preniesť jednoduchým násobením. Nanomolárna koncentrácia v kultivačnom médiu nie je dávka pre človeka a medzi miskou a človekom stoja distribúcia metylénovej modrej, jej redukcia na bezfarebnú formu v krvi a tkanivách, vystavenie svetlu aj membránový potenciál. Po štvrté, sondy vypovedajú o svojom vlastnom kompartmente. Oxidácia MitoCLox ukazuje, že vznikli mitochondriálne lipidové radikály; neukazuje, či sa prasknutiu plazmatickej membrány, pravdepodobnej konečnej udalosti, zabránilo priamo alebo sa mu predišlo zásahom v skoršom kroku.

Poctivý záver je teda tento: v týchto modeloch ROS pochádzajúce z komplexu I spolu so železom vyvolávajú peroxidáciu mitochondriálnych lipidov, ktorá predchádza ferroptóze, a metylénová modrá pri nízkych koncentráciách tento úsek prerušuje. Čokoľvek nad rámec tohto úseku si vyžaduje iné experimenty na zvieratách a následne na ľuďoch.