Článok
Alternatívy k metylénovej modrej pre mikroskopiu: výber podľa úlohy
Pri jednoduchom nátere baktérií môže kryštálová violeť nahradiť metylénovú modrú, ak je cieľom pozorovať tvar buniek. Pri živých bunkách môže byť lepšou alternatívou fázový kontrast úplne bez farbiva. Voľba závisí od pozorovania, ktoré potrebujete vykonať.
Predstavte si, že dvaja ľudia skúmajú rovnakú bakteriálnu kultúru. Jeden chce odlíšiť tyčinkovité bunky od guľatých. Druhý chce zistiť, či ošetrenie baktérie usmrtilo. Farbivo, ktoré prvému poskytne jasný obraz, nemusí druhému poskytnúť použiteľnú odpoveď.
Pred výberom náhrady dokončite túto vetu: „Potrebujem pozorovať ___ v ___ a bunky musia / nemusia zostať živé.“ Táto veta definuje úlohu, ktorú musí farbivo splniť.
Začnite vzorkou a otázkou
Najprv rozhodnite, či bunky musia zostať živé, a potom určte znak, ktorý potrebujete pozorovať:
- Bunky musia zostať živé: pri pohybe alebo tvare zvážte nefarbený fázový kontrast alebo DIC; pri jadrovej DNA zvážte Hoechst 33342 s fluorescenciou; pri integrite membrány vyberte validovaný test, napríklad SYTO 9 s propídiumjodidom.
- Bunky nemusia zostať živé: pri bakteriálnej morfológii zvážte jednoduché farbenie kryštálovou violeťou alebo negatívne farbenie nigrozínom; pri Gramovej reakcii použite kompletnú metódu Gramovho farbenia; pri jadrovej DNA vo fixovaných bunkách zvážte fluorescenciu DAPI. Pomocou tejto tabuľky porovnajte obmedzenia jednotlivých možností. Ide o voľbu metódy, nie o pokyny na zámenu fliaš v rámci existujúceho protokolu.
| Čo potrebujete pozorovať | Vzorka a vybavenie | Možná alternatíva | Hlavné obmedzenie |
|---|---|---|---|
| Tvar a usporiadanie baktérií | Pripravený bakteriálny náter; svetlé pole | Jednoduché farbenie kryštálovou violeťou | Zobrazuje morfológiu; neurčuje Gramovu reakciu ani životaschopnosť. |
| Obrysy buniek na tmavom pozadí | Bakteriologický preparát; svetlé pole | Negatívne farbenie nigrozínom | Záleží na príprave a zložení; nefarbená bunka nemusí byť živá. |
| Gramova reakcia | Pripravený bakteriálny náter; svetlé pole | Kompletná metóda Gramovho farbenia | Vyžaduje kompletnú sekvenciu činidiel a kontroly. |
| Pohyb alebo zmeny v živých bunkách | Kompatibilný mokrý preparát; fázový kontrast alebo DIC | Bez farbiva | Vyžaduje vhodnú optiku; kontrast neidentifikuje konkrétnu molekulu. |
| Jadrová DNA | Fixované bunky; fluorescencia | DAPI | Vyžaduje kompatibilné excitačné a emisné filtre. |
| Jadrová DNA v živých bunkách | Živé bunky; fluorescencia | Hoechst 33342 | Preniknutie do bunky nedokazuje, že podmienky zobrazovania sú neškodné. |
| Integrita bakteriálnej membrány | Nefixované baktérie; fluorescencia | SYTO 9 s propídiumjodidom | Farbenie membrány je nepriamym meraním životaschopnosti. |
Pri jednoduchom nátere nahraďte metódu opatrne
Kryštálová violeť je praktickým kandidátom, keď je úlohou jednofarebné zobrazenie bakteriálnej morfológie. Bacteriological Analytical Manual úradu FDA uvádza dve formulácie kryštálovej violeti vhodné na jednoduché farbenie. Použite zdokumentovanú formuláciu a príslušný spôsob prípravy; samotný názov farbiva neurčuje pracovné činidlo.
Kryštálová violeť sa používa aj pri Gramovom farbení, to však neznamená, že jednoduché farbenie kryštálovou violeťou je Gramovým farbením. V protokole Gramovho farbenia ASM závisí diferenciálny výsledok od postupného pôsobenia kryštálovej violeti, jódu, odfarbovania a kontrastného farbenia. Vynechaním týchto krokov sa mení to, čo možno z obrazu určiť. Toto rozlíšenie vysvetľuje článok jednoduché farbenie verzus Gramovo farbenie.
Nigrozín ponúka iný spôsob zvýraznenia obrysov: stmaví pozadie, zatiaľ čo bakteriálne bunky zostanú relatívne svetlé. V pokynoch spoločnosti Merck pre nigrozín sa nachádza dôležitý detail, ktorý môže všeobecný zoznam náhrad prehliadnuť. Uvedená pracovná formulácia obsahuje formaldehyd. Z označenia „negatívne farbenie“ preto nemožno usudzovať na kompatibilitu so živými bunkami, hoci samotné bunky vyzerajú ako nefarbené. Skontrolujte úplné zloženie a prípravu vzorky.
Pri živých vzorkách zvážte zmenu optiky
Ak chcete sledovať pohyb alebo delenie buniek, pridanie ďalšieho farbiva môže pozorovanie skomplikovať. Ako vysvetľuje Nikon vo svojom sprievodcovi kontrastom v priehľadných vzorkách, fázový kontrast a diferenciálny interferenčný kontrast, teda DIC, zviditeľňujú vzorky prostredníctvom rozdielov v ich optických vlastnostiach. Môžu zobraziť živé, nefarbené bunky, ak má mikroskop potrebné komponenty.
Táto voľba zachová nefarbený preparát, ale mení dostupné informácie. Môžete sledovať hranicu alebo pohyb bez toho, aby ste vedeli, ktorá molekula vytvorila kontrast. Ak je cieľom molekulárna lokalizácia, zvoľte namiesto toho vhodnú metódu značenia.
Pri jadrovej DNA porovnanie farbív DAPI a Hoechst od Invitrogen odlišuje bežné použitie DAPI s fixovanými bunkami od Hoechst 33342, ktorý ľahšie preniká do buniek a uprednostňuje sa pri značení živých buniek. Obe farbivá vyžadujú fluorescenčné vybavenie. Ani jedno nie je priamou náhradou farebného farbiva pre mikroskopiu v svetlom poli.
Expozíciu farbivu a osvetlenie považujte za experimentálne podmienky. Ak meriate správanie buniek, porovnajte farbené a nefarbené preparáty.
Červená bunka nie je automaticky mŕtva bunka
SYTO 9 a propídiumjodid sa často používajú spoločne na hodnotenie integrity bakteriálnej membrány. Príručka BacLight spája neporušené membrány so zeleným farbením a poškodené membrány s červeným farbením. Túto interpretáciu treba pre danú vzorku validovať.
Problém ilustruje štúdia Rosenberga a kolegov z roku 2019. V 24-hodinových biofilmoch E. coli na skle vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku sa približne 96% buniek in situ javilo ako pozitívnych na propídiumjodid. Autori však odhadli, že po zbere bolo kultivovateľných 82%. Konfokálne snímky ukázali bunky so zeleným vnútrom pod červeno sfarbeným materiálom, čo poukazovalo na extracelulárne nukleové kyseliny ako zdroj zavádzajúceho signálu.
Tieto percentá opisujú rôzne merania na preparátoch použitých v štúdii, nie univerzálny korekčný faktor. Užitočným záverom je overiť, čo signál vytvorilo. V biofilme môže farbivo nukleových kyselín detegovať materiál mimo buniek aj vo vnútri poškodených buniek. Pri závere o životaschopnosti výskumníci odporúčajú doplnkové merania, napríklad kultiváciu alebo metabolickú aktivitu, pričom uznávajú, že každá metóda má svoje obmedzenia.
Skontrolujte, čo alternatíva skutočne obsahuje
Alternatívna metóda farbenia môže stále obsahovať metylénovú modrú. Príkladom je Giemsa: Merck opisuje svoj produkt ako roztok azúru, eozínu a metylénovej modrej, určený okrem iného na nátery krvi a kostnej drene. Môže ísť o inú metódu pre inú vzorku, ale nespĺňa požiadavku na vylúčenie metylénovej modrej.
Ak je súčasťou experimentu vylúčenie určitej zlúčeniny, pred porovnávaním snímok skontrolujte identitu a zloženie činidla. Sprievodca metylovou modrou, metylénovou modrou a podobne pomenovanými farbivami vysvetľuje rozdiely v názvosloví.
Pred použitím výsledku overte náhradu
Pri novej metóde vykonajte malé porovnanie s použitím reprezentatívnych vzoriek a vhodnej kontroly. Nastavenia mikroskopu udržiavajte podľa možností porovnateľné. Zaznamenajte zloženie činidla, prípravu vzorky, expozíciu a podmienky zobrazovania, aby bolo možné lepšie vyzerajúcu snímku preskúmať, a nie iba uprednostniť.
Úspešnosť posudzujte podľa pôvodnej otázky. Pri morfológii posúďte, či sú hranice buniek a ich usporiadanie naďalej interpretovateľné. Pri značení jadra posúďte umiestnenie signálu a pozadie. Pri životaschopnosti požadujte dôkazy nad rámec vizuálne pôsobivého farebného rozlíšenia. Širší sprievodca farbením metylénovou modrou a laboratórnymi aplikáciami vysvetľuje, ako spolu súvisia pozorovanie a príprava.
Vyberte alternatívu, ktorá zachová meranie, ktoré potrebujete. Farba je iba jednou vlastnosťou výsledného obrazu.