Paul Ehrlich și albastrul de metilen: cum a contribuit un colorant la dezvoltarea procesului de descoperire a medicamentelor

Contribuția lui Paul Ehrlich la medicină nu a fost un medicament. A fost un argument despre felul în care ar trebui studiat unul.

În 1878, a depus o teză de doctorat a cărei secțiune introductivă se intitula „Concepția chimică asupra colorării”. Argumentul său era că procesul de colorare a unei secțiuni de țesut și vopsirea unei bucăți de material textil urmează aceeași logică. În ambele cazuri, culoarea se fixează datorită unei afinități chimice între colorant și material, nu pentru că țesutul este absorbant, gras sau are o formă care reține pigmentul. Ehrlich crescuse privindu-l pe vărul său, anatomopatologul Karl Weigert, pregătind secțiuni colorate, iar ceea ce îi reținea atenția nu erau imaginile, ci faptul că colorantul alegea unde să ajungă.

Afirmația pare modestă. Nu este. Dacă un colorant se leagă de un țesut din motive chimice, atunci distribuția colorării oferă informații despre chimia acelui țesut. O lamă colorată încetează să mai fie o ilustrație și devine o măsurătoare.

A dezvoltat imediat această idee. În 1880, a combinat albastrul de metilen cu fucsina acidă și a numit amestecul un colorant neutru, un neutralen Farbkörper, care diferenția tipurile de leucocite acolo unde coloranții individuali folosiți pe atunci nu reușeau. Doi ani mai târziu, a prezentat o metodă cu violet de metil pentru colorarea bacililor tuberculozei, iar Koch a adoptat procedura în propriile cercetări.

Teoria care a oferit ulterior acestor practici un fundament comun este o chestiune separată, iar datarea ei este adesea simplificată. Teoria catenelor laterale a lui Ehrlich, ideea că o substanță acționează asupra unei celule deoarece cele două sunt compatibile chimic, aparține anilor 1890, nu perioadei experimentelor cu coloranți. Cercetările anterioare au furnizat convingerea precursoare: selectivitatea este chimică și, prin urmare, poate fi căutată, nu doar descoperită din întâmplare.

Experimentul care a transformat colorantul într-o hartă

În 1885, Ehrlich a publicat o monografie despre necesarul de oxigen al organismului, având ca subtitlu „studiu prin analiza colorării”. Metoda sa consta în injectarea unor coloranți a căror culoare depinde de starea de oxidare, urmată de compararea modului în care diferite organe îi reduceau sau îi păstrau. Colorantul era folosit ca instrument, asemenea unui termometru: oferea informații despre condițiile din interiorul țesutului, care nu puteau fi investigate direct. Ehrlich însuși formula scopul ca fiind determinarea, cu ajutorul anumitor coloranți, a puterii reducătoare a organelor vii.

Rezultatul privind albastrul de metilen a apărut în 1886, într-o lucrare despre reacția colorantului cu substanța nervoasă vie, prezentată unei societăți medicale în luna decembrie a anului precedent. Albastrul de metilen era introdus în circulația unui animal viu, apoi se prelevau secțiuni subțiri de țesut și se expuneau la aer, astfel încât colorantul incolor acumulat să se oxideze, redevenind albastru și arătând unde se adunase. Celulele și fibrele nervoase se colorau suficient de selectiv încât tehnica a devenit o metodă standard pentru evidențierea țesutului nervos. Compusul nu mai era doar o substanță colorantă aplicată pe o secțiune moartă, pe masa de laborator. Era un marker care se distribuia în interiorul unui organism viu, iar distribuția sa putea fi interpretată.

Proprietatea aflată la baza ambelor experimente merită formulată clar, deoarece tot restul acestei istorii depinde de ea. Transformarea albastrului de metilen este reversibilă. Forma sa redusă, leuco-albastrul de metilen, este incoloră, iar în contact cu oxigenul revine la cationul albastru. O soluție a colorantului în glucoză, într-un borcan închis etanș, este incoloră; dacă borcanul este deschis, devine albastră. Se relatează că Ehrlich a demonstrat direct acest lucru, tratând secțiunile colorate cu clorură de fier, dar și expunându-le la aer, și observând revenirea culorii. Un colorant care își schimbă culoarea în funcție de starea redox a mediului înconjurător este o sondă pentru acel mediu.

Așadar, două proprietăți coexistau. Un colorant putea diferenția un țesut de altul. Iar culoarea unui colorant putea fi activată și dezactivată prin schimbarea stării de oxidare.

Privită retrospectiv, a doua proprietate reprezintă începutul chimioterapiei. Dacă un compus se leagă de un tip de țesut și nu de altul, atunci același compus ar putea ajunge la un tip de organism și nu la altul. Ehrlich a formulat direct deducția: dacă un agent patogen putea fi colorat selectiv, colorarea ar putea indica un efect nociv specific asupra acelui agent patogen. Prin urmare, un colorant ar putea fi folosit ca medicament, îndreptat împotriva unui invadator, nu împotriva pacientului.

Primul test la un pacient nu a vizat malaria. În 1890, împreună cu psihiatrul Arthur Leppmann, Ehrlich a raportat că albastrul de metilen ameliora durerea în afecțiuni nevralgice și reumatice ale mușchilor, articulațiilor și tendoanelor. Cei doi au discutat dacă medicamentul ar putea acționa asupra bolilor psihice și au decis să nu îl încerce. Un medic italian, Pietro Bodoni din Genova, a continuat totuși în această direcție. Titlul lucrării sale din 1899 se referă la o acțiune sedativă în diferite forme de psihoză: el a descris calmarea a paisprezece pacienți agitați și a observat că alți medici din Genova foloseau deja colorantul în același scop. Sedarea nu este un efect asupra bolii, iar această distincție revine mereu în această istorie.

Cercetările asupra malariei au urmat în 1891, împreună cu anatomopatologul Paul Guttmann, la spitalul Moabit din Berlin. Albastrul de metilen a fost administrat la doi pacienți, iar raportul a apărut în Berliner klinische Wochenschrift din 28 septembrie 1891. În primul caz, pacientul a luat 0.5 g de colorant într-o singură administrare, în seara de 29 iunie; criza așteptată nu s-a manifestat pe deplin, iar singura problemă consemnată ulterior a fost o strangurie ușoară, cu urină albastră. Crizele febrile au dispărut în primele zile, iar paraziții au dispărut din sânge cel târziu în a opta zi. Autorii au rezumat rezultatele spunând că așteptările lor fuseseră îndeplinite pe deplin. Două cazuri fără grup de control nu reprezintă o demonstrație. Prezentarea mai amplă a albastrului de metilen și a malariei, inclusiv studiile moderne, își are locul pe o pagină separată, iar întrebarea interesantă aici este mai restrânsă: cât din raționamentul lui Ehrlich a rezistat confruntării cu parazitul.

Unde a rezistat raționamentul și unde a eșuat

Nu a rămas prea mult din mecanism, cel puțin nu în forma propusă de Ehrlich. Versiunea simplă, în care un cation triciclic plan se strecoară între perechile de baze ale ADN-ului parazitului, nu se susține în cazul Plasmodium. Albastrul de metilen este redus atât de ușor de o hematie infectată, încât nu ajunge deloc la parazit sub forma unui cation plan, iar explicația prin intercalare, care se potrivește coloranților acridinici, nu se potrivește acestuia.

Ceea ce susțin dovezile este mai puțin ordonat. Albastrul de metilen inhibă glutation-reductaza parazitului la concentrații care pot fi atinse la un pacient. Blochează transformarea hemului în hemozoină, pigmentul inert pe care parazitul îl produce pentru a evita să fie otrăvit de propria digestie a hemoglobinei, aproximativ la fel de eficient ca clorochina și mult mai eficient decât chinina. Ciclul său redox generează și specii reactive de oxigen într-o celulă care le produce deja. Care dintre acestea este mecanismul real sau dacă toate contribuie rămâne încă neclar.

Mai există o complicație, care ar trebui să influențeze modul în care interpretăm orice afirmație istorică despre acest compus. Albastrul de metilen comercial din acea perioadă nu era o singură substanță. Probele conțineau Azure B, analogul monodemetilat, iar soluțiile mai vechi acumulau cantități mai mari din acesta. Azure B este un colorant metacromatic cu ținte diferite: colorează ADN-ul dublu catenar în albastru intens și ARN-ul în verde. Un amestec de doi coloranți cu destinații diferite, în proporții pe care nimeni nu le-a consemnat, nu poate susține o afirmație fără echivoc despre ce a făcut albastrul de metilen din el.

Colorantul în sine nu a înlocuit niciodată chinina. Metoda a avut mai mult succes. Wilhelm Roehl, elevul lui Ehrlich, care lucra pentru conglomeratul de coloranți și medicamente IG Farben, a continuat să promoveze derivații coloranților ca medicamente pentru bolile tropicale și a furnizat instrumentul care lipsea: canarul infectat cu o formă de malarie aviară, ca metodă de rutină pentru testarea preliminară a compușilor candidați. Werner Schulemann a modificat apoi catena laterală, iar sarea de fenotiaziniu rezultată a vindecat infecția experimentală. Încă îi colora pe pacienți în albastru.

Rezultatul durabil s-a dovedit a fi nici colorantul, nici sistemul de inele, ci catena laterală. Adăugarea unei grupări dialchilaminoalchilamino a schimbat comportamentul moleculei, iar fragmentul a supraviețuit tuturor modificărilor ulterioare. Dacă se păstrează acea grupare și se înlocuiește inelul de fenotiaziniu cu unul acridinic, rezultatul este chinacrina. Dacă se introduce un inel chinolinic, rezultatul este clorochina. Pamachina, primachina și amodiachina, toate încă prezente în catalogul antimalaricelor, poartă aceeași grupare. Compusul care a eșuat ca tratament a furnizat fragmentul care a reușit.

Legătura cu antipsihoticele trece prin inel, nu prin medicament. Elucidarea structurii albastrului de metilen l-a condus pe Heinrich August Bernthsen la nucleul de bază al fenotiazinei în 1883, iar chimiștii de la Rhône-Poulenc lucrau în anii 1940 la această structură de bază, substituită în diferite moduri, în căutarea unor antihistaminice. Unul dintre acești compuși a fost sintetizat spre sfârșitul anului 1950 și testat de chirurgul Henri Laborit, care a observat că îi lăsa pe pacienți calmi și indiferenți. Prima sa utilizare psihiatrică publicată, la un pacient cu manie, a avut loc în ianuarie 1952. Primul antipsihotic nu este atât un descendent al antimalaricului lui Ehrlich, cât o rudă îndepărtată a colorantului de la care acesta pornise.

Trei practici din acest episod care merită păstrate

1. „Primul medicament sintetic folosit în medicină” descrie o categorie, iar precizările necesare sunt mai ample decât sugerează expresia. Formula a devenit consacrată; o analiză frecvent citată a lui Schirmer și a colegilor săi, publicată în Neurobiology of Aging, numește albastrul de metilen primul medicament complet sintetic folosit vreodată în medicină. Hidratul de cloral a fost introdus ca sedativ sintetic în 1869, cu peste douăzeci de ani mai devreme. Lucrarea din 1891 oferă ea însăși o parte din răspuns, deoarece autorii săi numesc antipireticele sintetice care eșuaseră deja împotriva malariei, printre care chinolina, antipirina și antifebrina. Propriul compus arsenical al lui Ehrlich pentru sifilis a apărut și mai târziu. Versiunea susținabilă a afirmației privește metoda, nu întâietatea: albastrul de metilen se numără printre primii compuși sintetici aleși pentru a acționa împotriva unui anumit organism pe baza unei teorii chimice a selectivității.
2. Distribuția selectivă nu înseamnă beneficiu selectiv. Rezultatul obținut de Ehrlich în 1886 a fost că acest colorant ajunge în țesutul nervos. Unde ajunge un compus și ce face odată ajuns acolo sunt două măsurători diferite, iar prima este mult mai ușor de efectuat. În acest decalaj s-au situat, de atunci încoace, cele mai multe afirmații despre albastrul de metilen și creier.
3. Puritatea ține de dovezi, nu de marketing. Documentele istorice sunt ambigue tocmai din acest motiv. Diferențe structurale mici schimbă locul în care ajunge acest compus, motiv pentru care un certificat de analiză trebuie să fie asociat unui lot specific, nu oferit ca o simplă declarație că produsul este testat. Un vânzător care susține conformitatea cu monografia farmacopeică, dar testează doar metalele grele, afirmă mai mult decât susține raportul. Blupreme se aprovizionează cu albastru de metilen de la un producător farmaceutic și testează întreaga specificație prevăzută de monografie: identitate, puritate, impurități organice, solvenți reziduali, impurități elementale, reziduu la calcinare, limite microbiene și endotoxine bacteriene. Raportul este publicat alături de produs, iar pagina despre albastrul de metilen de grad USP explică aceste limite și de ce rezultatul pentru Azure B este primul care trebuie verificat.

Un parcurs cronologic al surselor

Succesiunea cronologică a momentelor importante, inclusiv chimia coloranților de dinaintea lui Ehrlich și gradele și specificațiile apărute după el, este prezentată separat în istoria albastrului de metilen, iar identitatea compusului în sine este explicată în ce este albastrul de metilen.

Planșele pe care se bazează această relatare, reproduse în analiza din 2012 a lui Krafts, Hempelmann și Skórska-Stania, nu sunt echivalente, iar un exemplu arată de ce. Planșa din 1891 este documentul primar al studiului; portretul din 1910 de lângă ea datează o reputație și nimic altceva. Paginile din caietul lui Andersag din 1934 sunt urma directă a substituției cu chinolină, scrisă de mâna chimistului.

Rezumatul onest al experimentelor lui Ehrlich cu coloranți este că a înțeles selectivitatea și a identificat ținta, dar a greșit mecanismul. Albastrul de metilen se concentrează într-adevăr în țesutul nervos și afectează într-adevăr parazitul malariei. Nu face al doilea lucru din cauza primului, iar explicația chimică pe care a oferit-o pentru ambele era greșită. Ceea ce a demonstrat fără putință de tăgadă a fost mai durabil decât un mecanism corect: un compus poate fi ales, nu doar găsit, și poate fi ales pe baza unor dovezi adunate înainte ca cineva să îl administreze unui pacient.