Alternative la albastrul de metilen pentru microscopie

Pentru un frotiu bacterian simplu, violetul de cristal poate înlocui albastrul de metilen atunci când obiectivul este observarea formei celulelor. Pentru celulele vii, o alternativă mai potrivită poate fi contrastul de fază fără nicio colorare. Alegerea depinde de observația pe care trebuie să o faceți.

Să presupunem că două persoane examinează aceeași cultură bacteriană. Una dorește să distingă bacilii de celulele rotunde. Cealaltă dorește să afle dacă un tratament a omorât bacteriile. O colorare care oferă primei persoane o imagine clară poate să nu ofere celei de-a doua niciun răspuns utilizabil.

Înainte de a alege un substitut, completați această propoziție: „Trebuie să observ ___ în ___, iar celulele trebuie / nu trebuie să rămână vii.” Această propoziție definește rolul pe care trebuie să îl îndeplinească metoda de colorare.

Începeți cu specimenul și întrebarea

Mai întâi stabiliți dacă celulele trebuie să rămână vii, apoi identificați caracteristica pe care trebuie să o observați:

Celulele trebuie să rămână vii: pentru mișcare sau formă, luați în considerare contrastul de fază fără colorare sau DIC; pentru ADN-ul nuclear, luați în considerare Hoechst 33342 cu fluorescență; pentru integritatea membranei, alegeți un test validat, precum SYTO 9 cu iodură de propidiu.
Celulele nu trebuie să rămână vii: pentru morfologia bacteriană, luați în considerare o colorare simplă cu violet de cristal sau o colorare negativă cu nigrozină; pentru reacția Gram, utilizați metoda completă de colorație Gram; pentru ADN-ul nuclear din celule fixate, luați în considerare fluorescența DAPI.

Folosiți acest tabel pentru a compara limitările fiecărei ramuri. Acestea sunt alegeri de metodă, nu instrucțiuni pentru înlocuirea reactivilor într-un protocol existent.

Ce trebuie să observați	Specimen și echipament	Alternativă posibilă	Limitarea principală
Forma și dispunerea bacteriilor	Frotiu bacterian preparat; câmp luminos	Colorare simplă cu violet de cristal	Evidențiază morfologia; nu stabilește reacția Gram sau viabilitatea.
Contururile celulelor pe un fundal întunecat	Preparat bacteriologic; câmp luminos	Colorare negativă cu nigrozină	Prepararea și formula sunt importante; o celulă necolorată nu este neapărat vie.
Reacția Gram	Frotiu bacterian preparat; câmp luminos	Metoda completă de colorație Gram	Necesită întreaga succesiune de reactivi și controale.
Mișcarea sau modificările celulelor vii	Preparat umed compatibil; contrast de fază sau DIC	Fără colorare	Necesită o optică adecvată; contrastul nu identifică o moleculă.
ADN nuclear	Celule fixate; fluorescență	DAPI	Necesită filtre compatibile de excitație și emisie.
ADN nuclear în celule vii	Celule vii; fluorescență	Hoechst 33342	Pătrunderea în celule nu demonstrează că condițiile de imagistică sunt inofensive.
Integritatea membranei bacteriene	Bacterii nefixate; fluorescență	SYTO 9 cu iodură de propidiu	Colorarea membranei este o măsură indirectă a viabilității.

Pentru un frotiu simplu, înlocuiți metoda cu atenție

Violetul de cristal este o opțiune practică atunci când este necesară o imagine monocromă a morfologiei bacteriene. Manualul Bacteriological Analytical Manual al FDA prezintă două formule cu violet de cristal adecvate pentru colorarea simplă. Utilizați o formulă documentată și metoda sa de preparare; simpla denumire a colorantului nu definește un reactiv de lucru.

Violetul de cristal este utilizat și în colorația Gram, dar acest lucru nu transformă o colorare simplă cu violet de cristal într-o colorație Gram. În protocolul ASM pentru colorația Gram, rezultatul diferențial depinde de acțiunea succesivă a violetului de cristal, iodului, decolorării și contracolorării. Omiterea acestor etape modifică ceea ce poate demonstra imaginea. Consultați colorarea simplă comparativ cu colorația Gram pentru această distincție.

Nigrozina oferă o modalitate diferită de evidențiere a contururilor: întunecă fundalul, în timp ce celulele bacteriene rămân comparativ deschise la culoare. Instrucțiunile Merck pentru nigrozină conțin un detaliu util care poate lipsi dintr-o listă generică de substituenți. Formula de lucru specificată conține formaldehidă. Prin urmare, nu puteți deduce compatibilitatea cu celulele vii doar din expresia „colorare negativă”, chiar dacă celulele în sine par necolorate. Verificați formula completă și modul de preparare a specimenului.

Pentru specimenele vii, luați în considerare schimbarea sistemului optic

Dacă doriți să urmăriți mișcarea sau diviziunea celulelor, introducerea unui alt colorant poate complica observația. După cum explică Nikon în ghidul său despre contrastul în specimene transparente, contrastul de fază și contrastul diferențial de interferență, sau DIC, fac specimenele vizibile prin diferențele proprietăților lor optice. Aceste metode pot evidenția celule vii, necolorate, cu condiția ca microscopul să dispună de componentele necesare.

Această alegere păstrează preparatul necolorat, dar modifică informațiile disponibile. Puteți urmări un contur sau o mișcare fără să știți ce moleculă a produs contrastul. Dacă întrebarea vizează localizarea moleculară, selectați în schimb o metodă adecvată de marcare.

Pentru ADN-ul nuclear, comparația Invitrogen între coloranții DAPI și Hoechst diferențiază utilizarea obișnuită a DAPI pentru celulele fixate de Hoechst 33342, care este mai permeabil pentru celule și este preferat pentru marcarea celulelor vii. Ambele necesită echipament de fluorescență. Niciunul nu reprezintă un înlocuitor direct pentru un colorant cromatic utilizat în câmp luminos.

Considerați expunerea la colorant și iluminarea drept condiții experimentale. Comparați preparatele colorate și necolorate atunci când comportamentul celulelor reprezintă măsurătoarea urmărită.

O celulă roșie nu este automat o celulă moartă

SYTO 9 și iodura de propidiu sunt adesea utilizate împreună pentru evaluarea integrității membranei bacteriene. Manualul BacLight asociază membranele intacte cu colorarea verde și membranele deteriorate cu colorarea roșie. Această interpretare trebuie validată pentru specimenul respectiv.

Un studiu din 2019 realizat de Rosenberg și colegii săi ilustrează problema. În biofilme de E. coli de 24 de ore pe sticlă, în soluție salină tamponată cu fosfat, aproximativ 96% dintre celule au apărut in situ ca fiind pozitive la iodură de propidiu. Totuși, autorii au estimat că 82% erau cultivabile după recoltare. Imaginile confocale au arătat celule cu interior verde sub material colorat în roșu, indicând acizii nucleici extracelulari drept o sursă a semnalului înșelător.

Aceste procente descriu măsurători diferite efectuate asupra preparatelor din studiu, nu un factor universal de corecție. Lecția utilă este să verificați ce a generat semnalul. Într-un biofilm, un colorant pentru acizi nucleici poate detecta material aflat în exteriorul celulelor, precum și în interiorul celulelor deteriorate. Pentru o concluzie privind viabilitatea, cercetătorii recomandă măsurători complementare, precum cultivarea sau activitatea metabolică, recunoscând în același timp că fiecare metodă are limitări.

Verificați ce conține de fapt alternativa

O metodă alternativă de colorare poate conține în continuare albastru de metilen. Giemsa este un exemplu: Merck își descrie produsul drept o soluție de azur-eozină-albastru de metilen, destinată unor aplicații care includ frotiurile de sânge și de măduvă osoasă. Poate fi o metodă diferită pentru un specimen diferit, dar nu îndeplinește cerința de excludere a albastrului de metilen.

Dacă excluderea unui compus face parte din experiment, verificați identitatea și formula reactivului înainte de a compara imaginile. Ghidul despre albastru de metil, albastru de metilen și coloranți cu denumiri similare explică diferențele de denumire.

Verificați substituția înainte de a utiliza rezultatul

Pentru o metodă nouă, efectuați o comparație la scară mică folosind specimene reprezentative și un control adecvat. Mențineți setările microscopului comparabile acolo unde este posibil. Înregistrați formula reactivului, prepararea specimenului, expunerea și condițiile de imagistică, astfel încât o imagine care arată mai bine să poată fi investigată, nu doar preferată.

Evaluați reușita în raport cu întrebarea inițială. Pentru morfologie, verificați dacă limitele celulelor și dispunerea lor rămân interpretabile. Pentru marcarea nucleară, evaluați localizarea semnalului și fundalul. Pentru viabilitate, solicitați dovezi suplimentare dincolo de o separare cromatică atractivă. Ghidul mai amplu despre colorarea cu albastru de metilen și aplicațiile de laborator explică modul în care observația și prepararea se corelează.

Alegeți alternativa care păstrează măsurătoarea de care aveți nevoie. Culoarea este doar una dintre proprietățile imaginii rezultate.