Poate albastrul de metilen să ocolească Complexul III mitocondrial? De ce studiile nu sunt de acord

Două laboratoare au investigat dacă albastrul de metilen poate ocoli un Complex III mitocondrial blocat. Unul a răspuns nu. Celălalt a răspuns da. Ambele aveau date.

Primul studiu, pe mitocondrii din creier de șoarece, a constatat că acest colorant nu poate face asta. Al doilea, pe mitocondrii cerebrale provenite de la trei specii de rozătoare, a constatat că poate, parțial. Un al treilea studiu, pe ficat de șoarece, este adesea citat în același context, dar a testat altceva. Dacă îl păstrăm în contextul său, jumătate din confuzie se risipește.

Nu există un mecanism universal de anunțat. Există trei experimente cu blocanți, doze și măsurători diferite. Citiți mai întâi condițiile. Concluziile decurg din ele.

Ce înseamnă ocolirea aici

Electronii intră în lanț prin Complexul I (din NADH) sau Complexul II (din succinat), trec prin Complexul III la citocromul c, apoi prin Complexul IV la oxigen. Gradientul creat pe parcurs este ceea ce celula consumă pentru a produce ATP.

Afirmația privind ocolirea presupune că albastrul de metilen preia electroni în amonte de un blocaj și îi cedează în aval. Colorantul oxidat preia electroni de la NADH sau de la componentele inițiale ale lanțului, devenind leuco-albastru de metilen, iar forma redusă îi transferă citocromului c sau înapoi în lanț. Dacă transferul ajunge în aval de blocaj, respirația și potențialul membranar se restabilesc parțial. Dacă ajunge la nivelul blocajului sau în amonte de acesta, nu se restabilește nimic.

Un detaliu al Complexului III determină o mare parte din această dispută. Complexul desfășoară un ciclu Q cu două situsuri de legare pentru inhibitori. Antimicina se leagă de situsul Qi. Mixotiazolul se leagă de situsul Qo. Un studiu care folosește doar unul dintre acești inhibitori a testat doar jumătate din complex.

Primul studiu: fără ocolire în mitocondriile din creier de șoarece

Gureev și colegii săi au folosit mitocondrii din cortexul șoarecilor C57BL/6, izolate cu digitonină și analizate la 0.1 mg de proteină pe ml. Substraturile au acoperit trei regimuri: piruvat plus malat, fiecare la 5 mM, succinat la 10 mM cu glutamat la 2 mM și L-prolină la 10 mM. Blocanții au fost rotenona la 1 micromolar (Complexul I) și antimicina la 1 microgram pe ml (Complexul III). Dozele de colorant au fost de 0.5, 1 și 2 micromolar, cu 1 micromolar drept concentrație principală. Metodele și înregistrările sunt prezentate în comunicarea din FEBS Letters.

Ocolirea Complexului I a funcționat. Rotenona a redus respirația stimulată de ADP de la aproximativ 121 la aproximativ 2 nmol pe minut pe mg, iar colorantul la 1 micromolar a restabilit-o la aproximativ 21. Potențialul membranar s-a restabilit cu piruvat plus malat și cu L-prolină.

Ocolirea Complexului III nu a funcționat. Antimicina a redus respirația la aproximativ 16, iar colorantul a crescut-o doar până la aproximativ 20. Potențialul membranar nu s-a restabilit cu niciun substrat, la doze de colorant de până la 5 micromolar. Datele privind peroxidul au indicat același lucru: colorantul singur a crescut emisia de peroxid de la o rată bazală de aproape 76 pmol pe minut pe mg la aproximativ 1170, 1460 și 1945 la cele trei doze, însă antimicina a redus acest semnal indus de colorant cu aproximativ 25, 88 și, respectiv, 96 la sută. Dacă forma redusă a colorantului ar fi reacționat direct cu oxigenul, blocarea Complexului III nu ar fi trebuit să suprime semnalul. Autorii au dedus că forma redusă a colorantului este oxidată la situsul Qo al Complexului III, în amonte de blocajul produs de antimicină. Bucla scurtă, în cuvinte: donatori către colorant, colorant către Qo, apoi traseul normal. Rotenona este ocolită. Antimicina nu.

Al doilea studiu: ocolire parțială la trei specii, la ambele situsuri ale inhibitorilor

Svab și colegii săi au extins protocolul experimental. Au folosit mitocondrii cerebrale de la șoareci, șobolani și cobai, izolate cu Percoll și analizate la aceeași concentrație de 0.1 mg pe ml, cu piruvat plus malat sau glutamat plus malat, fiecare la 5 mM. Au utilizat doi blocanți ai Complexului III: antimicină A la 0.3 micromolar și mixotiazol la 1 micromolar. Colorantul a fost folosit la 2 micromolar în majoritatea analizelor și la 0.5 în experimentele cu citocrom c. Toate cele trei specii, studiate prin protocoale comparabile, sunt prezentate în articolul cu acces liber.

Ambele blocaje au fost ocolite parțial, la toate cele trei specii. În mitocondriile de șoarece, antimicina a suprimat respirația, iar colorantul a crescut-o cu aproximativ 60 la sută, de la circa 37 la 59 nmol pe minut pe mg. Mixotiazolul a suprimat-o cu 88 la sută, până la aproximativ 4.5, iar colorantul a crescut-o de cinci ori, până la aproximativ 23. Potențialul membranar s-a repolarizat parțial în prezența oricăruia dintre inhibitori, fiind măsurat cu doi coloranți (safranină O și TMRM ratiometric) pentru a exclude artefactele optice.

Acest articol a testat și transferul direct, lucru pe care primul studiu nu l-a făcut. Citocromul c acetilat exogen, la 25 micromolar, nu a fost redus de mitocondriile energizate, cu sau fără inhibitori, însă adăugarea colorantului a determinat reducerea în ambele cazuri. Într-un tampon fără celule, NADH plus colorantul au redus citocromul c cu o viteză proporțională cu NADH. Saltul mai lung, în cuvinte: echivalenți reducători către colorant, colorant direct către citocromul c, Complexul IV către oxigen. Acest traseu evită complet Complexul III, astfel că ambele blocaje pot fi ocolite.

Două măsurători suplimentare susțin această interpretare. Fluorescența NAD(P)H a scăzut când colorantul a fost adăugat mitocondriilor tratate cu mixotiazol, ceea ce înseamnă că echivalenții reducători au fost consumați prin noul traseu. Iar absorbanța colorantului la 660 nm a urmărit fiecare adăugare pe rând, în timp ce supernatantele obținute prin centrifugare au arătat o acumulare de peste o sută de ori a colorantului oxidat în interiorul mitocondriilor energizate, urmată de ieșirea acestuia când potențialul s-a prăbușit. Și bilanțul protonilor se potrivește: evitarea etapelor de pompare lasă aproximativ 2 protoni pentru fiecare pereche de electroni, în loc de 10, astfel că utilizarea mai rapidă a oxigenului, cu repolarizare doar parțială, este ceea ce caracterizează o ocolire reală, nu o dovadă împotriva ei.

Același preparat a produs răspunsuri care sancționează o lectură superficială. În prezența inhibitorului și a colorantului, ADP a redus respirația în loc să o crească, iar blocarea transportului a stimulat-o în loc să o încetinească, în timp ce potențialul membranar continua să se modifice în direcțiile normale. Consumul de oxigen, luat singur, induce în eroare în acest sistem.

Al treilea studiu: studiul pe ficat care a testat Complexele I și II, nu III

Lee și Boelsterli au folosit mitocondrii din ficat de șoarece și hepatocite în cultură afectate de efavirenz (Complexul I, IC50 de aproape 30 micromolar) și hidrazină, metabolitul izoniazidei (Complexul II, IC50 de aproape 30 micromolar). Colorantul la aproximativ 30 micromolar a restabilit oxidarea NADH, potențialul membranar și ATP, reducând totodată oxidanții și moartea celulară necrotică. Articolul din Redox Biology descrie un model în care colorantul transportă electronii pe un traseu care ocolește Complexele I și II afectate.

Acest rezultat oferă un context confirmat pentru partea din amonte și nu spune nimic despre Complexul III, deoarece în acel studiu nu a fost blocat nimic la acest nivel. Nu poate confirma sau infirma niciunul dintre studiile pe creier.

Matricea condițiilor

Patru motive pentru care ambele studii despre Complexul III pot avea dreptate în propriile condiții experimentale

1. Blocantul nu a reprezentat aceeași intervenție. Antimicină singură la 1 microgram pe ml, comparativ cu antimicină la 0.3 micromolar plus un blocant separat al situsului Qo. Un traseu prin care colorantul livrează electroni către situsul Qo eșuează exact acolo unde un traseu direct către citocromul c reușește. Un singur situs nu poate ține locul ambelor.

2. Doza de colorant și intervalele de timp au fost diferite. Concentrații principale de 1 față de 2 micromolar, pentru o substanță care participă la cicluri redox și a cărei captare și reducere directă a citocromului c depind de concentrație și de timp. Diferențele mici de doză, împreună cu momente diferite ale măsurării, pot pune în evidență ramuri diferite ale aceleiași rețele.

3. Preparatele au fost diferite. Izolarea cu digitonină, comparativ cu izolarea pe gradient de Percoll, selectează populații mitocondriale care se suprapun, dar nu sunt identice. Concentrația de proteină a fost aceeași, de 0.1 mg pe ml, deci această variabilă este exclusă, dar subpopulația și integritatea nu sunt. Iar specia a fost exclusă ca explicație: al doilea grup și-a reprodus fenotipul și la șoarece.

4. Condițiile de substrat determină ce poate face colorantul. Trei regimuri de substrat, comparativ cu perechi legate de NADH. Disponibilitatea NADH și potențialul membranar stabilesc împreună cât de repede este redus colorantul și unde se distribuie, iar un traseu care necesită colorant redus lângă citocrom c oxidat depinde de această alegere.

Cum să evaluați următoarea afirmație privind ocolirea

Întrebați ce complex a fost blocat, cu ce inhibitor, la ce situs și la ce doză. Întrebați care a fost concentrația colorantului și când s-a făcut măsurarea. Întrebați despre țesut, specie, izolare, concentrația de proteină și substrat. Și întrebați dacă potențialul, respirația, starea redox și o analiză a transferului direct sunt concordante, deoarece consumul de oxigen, luat singur, a indicat aici o direcție greșită de mai multe ori.

Rezumatul strict rămâne valabil. Ocolirea Complexului I prin colorant este acceptată. În cazul Complexului III, mitocondriile de șoarece cu antimicină la 1 microgram pe ml și colorant la 1 micromolar nu prezintă o ocolire funcțională, în timp ce trei specii cu antimicină la 0.3 micromolar sau mixotiazol la 1 micromolar și colorant la 2 micromolar prezintă o ocolire parțială, cu transfer direct de la colorant la citocromul c. Aceste afirmații pot coexista. Orice concluzie mai largă este o extrapolare.

Lecturile conexe mențin afirmația disputată în cadrul chimiei necontestate: cum transferă albastrul de metilen electronii pentru mecanismul de transfer, experimentele de ocolire a Complexului I pentru cazul confirmat din amonte, măsurarea potențialului membranar și artefactele asociate pentru a înțelege de ce au fost necesari doi coloranți și manipularea în laborator a substanțelor care participă la cicluri redox pentru capcanele legate de dozare și de intervalele de timp.