De ce absorbția albastrului de metilen se schimbă odată cu concentrația

Luați o sticlă cu soluție stoc de albastru de metilen și turnați în două pahare. Umpleți primul pahar cu soluția stoc și al doilea cu o diluție de zece ori. Al doilea pahar este mai pal, așa cum era de așteptat. Priviți cu atenție și veți observa că s-a schimbat și altceva. Nuanța este diferită. O soluție tinde spre un albastru senin, ca cerul, iar cealaltă spre un albastru cu tentă violetă. Diluarea nu a redus doar intensitatea. A schimbat specia chimică responsabilă pentru cea mai mare parte a absorbției.

Ideea din spatele acestei schimbări este simplă. Albastrul de metilen dizolvat nu reprezintă o singură specie. Cationul individual al colorantului, numit monomer, se poate suprapune față în față cu un al doilea cation pentru a forma un dimer, iar dimerii pot forma agregate mai mari. Fiecare formă are propriul spectru de absorbție. Ceea ce raportează un spectrofotometru este suma contribuțiilor amestecului prezent în acea cuvetă, în acele condiții. Modificați amestecul și spectrul se schimbă, chiar dacă conținutul total de colorant urmează un raport simplu de diluție.

Monomerul și dimerul absorb diferit

Imaginați-vă monomerul ca pe o carte de joc plată, cu o sarcină pozitivă distribuită pe sistemul său de inele. Două astfel de cărți se pot așeza față în față. Sarcinile pozitive se resping, dar suprafețele aromatice plane se atrag prin interacțiuni de suprapunere, iar apa și contraionii din jur ecranează repulsia. Rezultatul este o pereche legată, cu stări electronice comune. Tranzițiile sale permise au o energie mai mare decât tranziția monomerului, astfel că banda dimerului apare la o lungime de undă mai scurtă decât banda monomerului, iar agregatele mai mari contribuie și mai mult spre zona albastră, sub forma unui umăr spectral.

La o concentrație foarte mică în apă curată, predomină monomerii, iar banda de la lungimea de undă mai mare este dominantă. Pe măsură ce concentrația totală crește, forma asociată în perechi ocupă o proporție tot mai mare, iar banda de la lungimea de undă mai scurtă crește în raport cu prima. Raportul dintre cele două benzi indică, așadar, compoziția amestecului, nu direct concentrația totală. O citire la o singură lungime de undă nu poate separa cele două forme fără o ipoteză despre forma prezentă.

De aceea, spectrele de referință trebuie însoțite întotdeauna de condițiile de măsurare. Referința spectrală pentru albastrul de metilen prezintă în tabel pozițiile benzilor împreună cu solventul, compoziția salină de fond, pH-ul, temperatura și intervalul de concentrație în care au fost obținute. Dacă citați un maxim fără aceste condiții, valoarea nu este suficient definită. Două laboratoare pot raporta corect spectre diferite ale aceluiași colorant, deoarece au măsurat amestecuri diferite.

Ce deplasează echilibrul

Concentrația este principalul factor. Formarea dimerilor necesită întâlnirea a doi monomeri, astfel că proporția lor crește mai rapid decât liniar în raport cu cantitatea totală de colorant. Constantele de dimerizare raportate în mediu apos sunt de ordinul miilor per molar în apropierea temperaturii camerei, astfel că proporția dimerilor crește accentuat în domeniul micromolar. O ajustare globală amplă, care a acoperit concentrații de colorant de la domeniul micromolar la cel milimolar, a identificat o contribuție nenulă a tetramerilor chiar sub 34 micromolar, ceea ce avertizează asupra limitelor unei ajustări bazate strict pe două specii la zeci de micromolar. Proporțiile exacte depind de mediu, motiv pentru care acest articol indică tendințe, nu oferă un tabel universal de conversie.

Sarea este al doilea factor. Ionii dizolvați ecranează repulsia dintre doi cationi, astfel că adăugarea clorurii de sodiu și a unor electroliți similari deplasează amestecul spre dimeri și agregate la aceeași concentrație de colorant. Acest efect este vizibil în studiile privind agregarea albastrului de metilen în medii saline și apoase, în care colorantul, la concentrații de aproximativ 1 micromolar până la 3.4 milimolar, a fost măsurat la concentrații de clorură de sodiu între 0 și 0.15 molar. În acea ajustare, fracția de tetrameri a ajuns la aproximativ 0.93 în zona cu concentrații mari atât de colorant, cât și de sare. Prin urmare, un spectru înregistrat în apă și unul înregistrat în soluție salină fiziologică nu sunt etaloane interschimbabile.

Temperatura acționează în sens opus. Suprapunerea eliberează apa legată și este contracarată de mișcarea termică, astfel că încălzirea unei soluții disociază de obicei o parte dintre dimeri înapoi în monomeri, în timp ce răcirea favorizează asocierea. Entalpia de disociere obținută prin ajustare este negativă, de aproximativ minus 30 kilojouli per mol în intervalul de la 282 la 333 kelvin, ceea ce confirmă asocierea exotermă. O probă rece, măsurată imediat după refrigerare, poate părea mai agregată decât aceeași probă măsurată după echilibrarea la temperatura camerei.

Solventul stabilește condițiile de bază. Apa, prin efectul său hidrofob puternic, favorizează suprapunerea cationilor plați ai colorantului. Alcoolii precum etanolul și metanolul solvatează mai bine inelele și desfac agregatele, astfel că, la aceeași concentrație de colorant, proporția monomerilor este mai mare în etanol decât în apă. Cosolvenții aprotici au același efect: în amestecuri de apă și DMSO la 293 kelvin, adăugarea de DMSO a inhibat dimerizarea, ceea ce indică structura apei ca factor favorizant al suprapunerii. Surfactanții necesită atenție în ambele sensuri. Peste concentrația lor micelară critică, micelele pot solubiliza monomerii individual și pot restabili un spectru asemănător celui al monomerului. Sub acel prag, un surfactant cu sarcină opusă poate, în schimb, să favorizeze suprapunerea: la o concentrație de colorant de 100 micromolar, polimerizarea indusă de SDS a atins un maxim în apropierea concentrației de 4 milimolar SDS, aproximativ jumătate din pragul de formare a micelelor, înainte de redistribuirea la concentrații mai mari de surfactant. Cercetările privind efectele interacțiunii colorant-solvent și ale mediilor organizate asupra spectrelor albastrului de metilen ilustrează cât de puternic determină vecinătatea moleculară imediată, nu doar concentrația globală, benzile observate.

pH-ul contează în principal la extreme. În intervalul apropiat de neutralitate, folosit în majoritatea activităților de laborator, albastrul de metilen rămâne în forma sa cationică albastră obișnuită, iar agregarea domină comportamentul spectral. Mediile puternic acide sau bazice, reacțiile redox care produc forma leuco incoloră ori legarea de proteine și particule adaugă fiecare stări dincolo de perechea monomer-dimer. Când un spectru se schimbă după adăugarea unei soluții tampon, verificați compoziția tamponului pentru săruri și componente capabile de legare înainte de a atribui totul doar pH-ului. Referința privind chimia și protonarea tratează aceste întrebări despre identitatea chimică separat de problema agregării abordată aici.

De ce se curbează dreapta Beer-Lambert

Relația Beer-Lambert spune că absorbanța este egală cu absorptivitatea înmulțită cu concentrația și cu lungimea drumului optic. Este o lege de numărare. Ea presupune că obiectele numărate rămân identice când numărul lor se schimbă: o singură specie absorbantă, spectru fix, fără modificări chimice odată cu concentrația, lumină de sondare monocromatică, fără împrăștiere sau reemisie și lumină care parcurge efectiv drumul declarat.

Agregarea încalcă prima ipoteză. Formal, absorbanța totală rămâne o sumă a contribuțiilor speciilor: lungimea drumului optic înmulțită cu fiecare absorptivitate și cu concentrația speciei respective. Fiecare specie respectă legea. Amestecul nu o respectă, deoarece concentrațiile speciilor sunt funcții neliniare ale cantității totale de colorant. Prin urmare, o curbă de calibrare a absorbanței la banda monomerului în funcție de cantitatea totală de colorant începe ca o dreaptă la concentrații foarte mici și se curbează în jos pe măsură ce concentrația crește, deoarece fiecare cantitate adăugată aduce proporțional mai puțin monomer. O curbă citită la banda dimerului se curbează în sens opus. Cercetările privind agregarea identifică exact acest mecanism drept sursa abaterilor Lambert-Beer observate. Ajustarea unei drepte prin regiunea curbată și extrapolarea ei reprezintă eroarea clasică. Dreapta este valabilă doar în intervalul și în matricea pentru care a fost construită.

Diluarea creează o capcană înrudită. Diluarea unei soluții stoc concentrate pentru a ajunge în intervalul instrumentului nu păstrează raportul dintre specii. Proba diluată din cuvetă își restabilește echilibrul spre monomer, astfel că spectrul ei descrie corect proba diluată, dar descrie incorect soluția stoc. Recalcularea spectrului soluției stoc prin multiplicarea absorbanțelor reconstituie estimarea conținutului total numai dacă calibrarea ține deja cont de această schimbare. Nu reconstituie niciodată forma inițială a benzilor. Oricine compară spectrul unei soluții concentrate cu o referință diluată compară două amestecuri diferite.

Lungimea drumului optic face parte din rezultat

Absorbanța este proporțională cu distanța parcursă de lumină prin probă. O cuvetă de 10 mm produce o absorbanță de zece ori mai mare decât o cuvetă de 1 mm care conține aceeași soluție. Această proporționalitate este exactă doar pentru aceeași soluție, iar agregarea face ca această precizare să fie esențială.

În practică, lungimea drumului optic este un instrument pentru menținerea în intervalul valid. Un drum lung oferă sensibilitate pentru soluții diluate, predominant monomerice. Un drum scurt menține o probă concentrată în domeniul de măsurare fără o diluare importantă care ar restabili echilibrul. Programul de cercetare a agregării din care provin valorile de mai sus a folosit exact această abordare: cuvete de 1 centimetru pentru concentrații de colorant între 1.1 și 34 micromolar și cuvete de 0.01 centimetri pentru concentrații între 94 micromolar și 3.4 milimolar. Platformele de măsurare pentru microvolume și cititoarele de plăci adaugă propria geometrie, cu drumuri optice scurte și uneori variabile, plus suprafețe pe care colorantul cationic se poate adsorbi. Raportați lungimea drumului optic împreună cu valoarea, la fel cum referința spectrală raportează solventul și sarea. O absorbanță fără lungimea drumului optic nu este un rezultat. Este un zvon.

Rigoarea măsurării decurge din mecanism. Aduceți probele la aceeași temperatură înainte de citire. Folosiți același tip de cuvetă și aceeași orientare, probe martor corespunzătoare, cu aceeași compoziție de fond de sare și tampon, și sticlărie curată, deoarece albastrul de metilen se adsorbe pe sticlă și plastic, iar o cuvetă pătată păstrează memoria ultimei probe concentrate. Efectuați citirea imediat după preparare atunci când cinetica agregării contează și construiți fiecare curbă de calibrare în aceeași matrice și la aceeași lungime a drumului optic ca pentru probele necunoscute. Pentru verificările vizuale, amintiți-vă că ochiul este un spectrometru slab. Întrebarea dacă culoarea soluției poate stabili puritatea este distinctă și are un răspuns negativ, iar schimbările de nuanță produse de agregare sunt unul dintre motive.

O diagramă de păstrat lângă instrument

Figura de mai jos rezumă articolul într-o singură referință pentru masa de laborator. Cele trei soluții conțin același colorant, dar diferă prin concentrația totală și compoziția salină de fond. Spectrele lor schematice arată cum banda monomerului de la lungimea de undă mai mare pierde din pondere în favoarea benzii dimerului de la lungimea de undă mai scurtă, pe măsură ce suprapunerea crește. Condițiile sunt înscrise pe figură, deoarece fără ele curbele nu pot fi reutilizate. Pentru poziții ale benzilor măsurate în condiții specificate, folosiți referința spectrală. Pentru modul în care colorantul pătrunde în celule odată ce se află în soluție, consultați pătrunderea în celule prin reducere și partiționare. Pentru modul în care doza de lumină și geometria influențează suplimentar rezultatele măsurătorilor fotochimice, consultați expunerea la lumină și geometria măsurării.

Regula de reținut are două părți. Spectrul identifică amestecul prezent în cuvetă în condițiile specificate. Numai o calibrare construită în aceleași condiții transformă o absorbanță într-o concentrație totală.