Quem desenvolveu a coloração púrpura do sangue? Azul de metileno, Malachowski, Romanowsky e Giemsa

A eosina é vermelha. O azul de metileno é azul. Misture os dois, aplique a mistura a um esfregaço de sangue seco e algumas partes do esfregaço surgem púrpura.

Não todas. Numa boa preparação, os núcleos dos leucócitos adquirem uma tonalidade vermelho-púrpura e, no interior de um parasita da malária, a cromatina adquire a mesma cor, enquanto os eritrócitos circundantes permanecem cor-de-rosa e o citoplasma permanece cinzento-azulado. É o púrpura que permite distinguir os diferentes tipos celulares.

Nenhum dos frascos contém púrpura. A cor só aparece quando um determinado produto de degradação do azul de metileno encontra a eosina na lâmina e, nas décadas de 1880 e 1890, ninguém sabia que esse produto existia, muito menos o que era. As pessoas que procuravam obter essa cor trabalhavam com corantes impuros, isoladamente, sem qualquer forma fiável de determinar o que havia num frasco depois de este ter ficado dois meses numa prateleira.

É por isso que a pergunta do título tem mais do que uma resposta defensável e que a resposta mudou em 2011.

Uma leitura que mudava com a mistura

A coloração não foi inventada. Foi-se construindo. Cada alteração da mistura permitiu obter exatamente uma nova informação visível, e a sequência dessas informações é a forma mais clara de interpretar a história.

O padrão da última coluna é o mais importante. Cada avanço alargou a gama de cores e cada alargamento tornou visível mais uma estrutura. O púrpura não é um adorno da técnica; é a diferença entre ver que um parasita está presente e ver de que é constituído. A forma como o próprio corante saiu de uma fábrica de corantes da BASF e entrou na medicina constitui uma história mais longa, com documentação própria. A sequência completa acima, com a fonte correspondente a cada entrada, é mantida numa cronologia dos intervenientes com ligações às fontes.

Figura: as mesmas seis misturas representadas segundo o que estava no recipiente e o que delas resultava. Os círculos contêm os corantes; os blocos por baixo mostram as cores que esses corantes podiam produzir num esfregaço de sangue. Nada antes de 1890 apresenta um bloco vermelho-púrpura e nada depois dessa data o omite.

O homem que usou bórax de propósito

Ernst Malachowski era médico em Breslau, hoje Wrocław, e passou a carreira em prática privada e numa pequena clínica que geria com um colega, realizando trabalho laboratorial no seu próprio tempo. Nasceu em Strzelno a 12 de março de 1857, estudou medicina na Universidade de Breslau e trabalhou de 1882 a 1887 como assistente de medicina interna no Hospital de Todos os Santos, então o segundo maior hospital da Alemanha.

Começou em 1888 com a coloração dupla de Chęciński e Plehn. Numa preparação feita em 1889, observou que a cromatina do núcleo do plasmódio se corava de forma diferente do citoplasma e depois verificou que não conseguia reproduzir o resultado. Tentou acidificar o azul de metileno, o que piorou a situação. Tentou alcalinizá-lo com bórax, o que funcionou sempre. Demonstrou publicamente o método em 15 de junho de 1890 e publicou uma descrição mais completa em agosto de 1891, incluindo a instrução relativa ao bórax. Assinalou que a coloração demorava vinte e quatro horas e que os resultados eram facilmente reprodutíveis.

Vinte e quatro horas é muito tempo num laboratório de diagnóstico, e o seu artigo não se demorou sobre a cor vermelho-púrpura do núcleo do parasita. Seja qual for a razão, ninguém adotou a alcalinização deliberada do azul de metileno até Nocht voltar a fazê-lo em 1898. Malachowski nunca mais escreveu sobre coloração sanguínea.

A razão pela qual até há pouco tempo se sabia tão pouco sobre ele é arquivística, não misteriosa. Quase nenhum vestígio da sua vida sobreviveu na literatura médica e o pouco que sobreviveu chegou por uma única via. A sua filha Marie deixou a Alemanha e foi para Londres em 1939, serviu no Exército Britânico e estabeleceu-se no Canadá, e a sua coleção de documentos familiares acabou no Leo Baeck Institute, em Nova Iorque. O irmão, Leo, foi morto na Primeira Guerra Mundial. A irmã, Eva, foi deportada de Breslau para o campo de trânsito de Izbica em abril de 1942 e nunca regressou. A mãe, Hedwig, suicidou-se em 22 de abril de 1942 em vez de esperar pela mesma deportação. Malachowski tinha morrido em 1934, antes de tudo isso.

Uma história familiar que termina desta forma é uma história familiar que deixa de ser citada. Os dois artigos que voltaram a colocar Malachowski no desenvolvimento da coloração, ambos publicados em 2011, foram elaborados a partir de documentos de arquivo de Poznań e Wrocław e dos documentos de Marie em Nova Iorque.

Um frasco com bolor e um russo afortunado

Dmitri Romanowsky estudou medicina na Academia Médica Militar de São Petersburgo e trabalhou sobre a malária durante a maior parte da sua carreira. Em 1890 publicou um método que, no papel, era quase idêntico ao de Chęciński: azul de metileno inalterado e eosina, com um pouco mais de eosina.

Em setembro de 1891 publicou o método que lhe deu notoriedade, e o pormenor decisivo estava escondido nas instruções. Os melhores resultados provinham de die vorräthige Methylenlösung, uma solução de reserva de azul de metileno que tinha permanecido mais de dois meses com bolor a crescer nela. O bolor e o tempo de repouso tinham desmetilado parcialmente o corante. Romanowsky não sabia disso e não conseguia controlar o processo, e outros investigadores que tentaram o seu método não conseguiram obter o púrpura. A sua tese tinha sido submetida em São Petersburgo em junho de 1891, razão pela qual a narrativa habitual considera 1891 o ano da descoberta.

A demonstração de Malachowski tinha ocorrido em junho de 1890, mais de um ano antes, e o seu método funcionava de propósito.

Porque o epónimo foi atribuído ao homem errado

O argumento a favor de Malachowski foi reunido por Kristine Krafts, Ernst Hempelmann e Barbara Oleksyn e assenta em quatro pontos. A data da demonstração pública, junho de 1890 contra setembro de 1891. A palavra deliberado contra a palavra serendipitoso. O facto de Malachowski ter publicado o seu método, incluindo o bórax, enquanto o de Romanowsky dependia de uma variável não controlada. E a observação de que a descrição do núcleo do plasmódio, juntamente com o púrpura que o revelava, praticamente desapareceu da literatura durante sete anos, porque ninguém conseguia reproduzir a versão acidental.

São inequívocos quanto à conclusão. No artigo biográfico chamam à atribuição "uma deturpação" e citam Ralph Lillie, que em 1978 escreveu que "talvez devêssemos referir-nos a esta família de colorações como colorações de Malachowski".

A reivindicação é contestada, como normalmente acontece com reivindicações de prioridade, e vale a pena explicar a forma dessa disputa em vez de a resolver. Um argumento sobre prioridade tem de definir em que consistiu a descoberta. Se a descoberta for a cor púrpura, Malachowski tem a demonstração documentada mais antiga. Se a descoberta for o método publicado, ambos os homens publicaram em 1891 e o epónimo foi atribuído a Romanowsky. Se a descoberta for a explicação, nenhum dos dois pode reivindicá-la, porque nenhum sabia que a maturação correspondia a desmetilação e nenhum conseguia explicar por que razão a cor aparecia. Este último ponto é o que as versões populares omitem. O ingrediente ativo era uma impureza que ninguém tinha identificado, e a primeira pessoa a produzir deliberadamente a cor fê-lo a partir de uma receita empírica reprodutível, não de uma compreensão do que essa receita fazia.

Os dois artigos de 2011 constituem a exposição publicada mais completa do argumento a favor de Malachowski, e ambos podem ser lidos gratuitamente no PubMed: a revisão extensa em PMID 21235291 e o artigo biográfico em PMID 21660627. O registo do PubMed relativo à revisão também lista um comentário sobre ela, publicado na mesma revista mais tarde nesse ano em 86(5):366, o que constitui um bom lembrete de que o argumento foi contestado por escrito assim que surgiu.

O que a disputa não é é uma divergência sobre química. Todos os envolvidos concordam sobre o que é o púrpura e quais os componentes que o produzem. A divergência diz respeito a quem lá chegou primeiro e a saber se um acaso que ninguém conseguia repetir conta, sequer, como ter lá chegado.

O que os nomes posteriores trouxeram

Se Malachowski produziu primeiro o púrpura, porque é que a coloração tem os nomes de Romanowsky, Wright e Giemsa?

Porque uma coloração que funciona uma vez nas mãos do seu inventor não é um reagente. O trabalho posterior transformou uma mistura temperamental em algo que um técnico noutro país podia utilizar numa terça-feira.

Nocht chegou lá através do raciocínio. Depois de não conseguir obter um resultado fiável a partir de um simples corante neutro, concluiu que o púrpura tinha de provir de algo presente no azul de metileno que não era azul de metileno e começou a procurá-lo. Unna já tinha observado que soluções envelhecidas de azul de metileno coravam de vermelho os grânulos dos mastócitos e propôs que se formava uma nova substância à medida que o corante maturava. Bernthsen tinha demonstrado em 1885 que condições alcalinas removem grupos metilo do azul de metileno e que esses produtos são aquilo a que hoje chamamos azures. Nocht extraiu a fração ativa com clorofórmio e só lhe conseguiu chamar Rot aus Methylenblau, vermelho do azul de metileno; Michaelis deu-lhe o nome de azure I em 1901. Jenner resolveu a logística. A redissolução do precipitado de azul de metileno e eosina em metanol absoluto produziu uma única solução estável que fixava o esfregaço enquanto o corava e pôs fim à fixação pelo calor. Leishman e Reuter combinaram corante policromático com um solvente alcoólico e conseguiram simultaneamente estabilidade e púrpura. Wright substituiu uma incubação de doze horas a 65 °C e dez dias de repouso por uma hora em vapor corrente. Giemsa deixou por completo de depender de uma solução maturada aleatoriamente, utilizando quantidades medidas de corantes conhecidos com glicerol no metanol para que o produto resistisse ao calor tropical. Nunca publicou a forma como produzia azure de metileno puro. Vendeu-o ao laboratório do Dr Grübler, em Leipzig, que o comercializou como azure I e afirmou que apenas a sua versão constituía uma coloração de Giemsa autêntica.

A identidade desse azure continua a ser discutida. Alguns defendem que era simplesmente azul de metileno policromático; outros, que era rico em Azure B. A resposta surgiu em consequência de uma guerra. Quando os corantes alemães deixaram de estar disponíveis, uma equipa do Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos, Ralph Lillie com Maurice Roe e Aimee Wilcox, verificou que a melhor coloração resultava de três componentes separados: azul de metileno não modificado, o seu produto de degradação desmetilado Azure B e eosina. Azure B substituiu o indisponível azure I, e esses três componentes continuam a constituir a base da coloração utilizada atualmente no diagnóstico da malária.

A química da interação desses três componentes numa lâmina é uma questão separada e corresponde a outra página. A página sobre as funções dos corantes e a química das colorações do tipo Romanowsky explica o que fazem o Azure B e a eosina e porque é que o par produz uma cor que nenhum deles produz isoladamente. A página sobre microscopia e aplicações laboratoriais aborda o lado prático: o que uma determinada preparação mostra e como avaliar se um produto específico é adequado ao método que pretende utilizar.

A parte da história que continua atual

Há um pormenor nesta história que não deixou de ser verdadeiro em 1902. Durante cerca de cinquenta anos, o componente mais importante da coloração padrão mundial para a malária foi uma impureza sem nome. Estava presente por acaso, a sua quantidade variava de frasco para frasco, a sua identidade foi um segredo comercial durante parte desse período e a sua proporção foi discutida até à década de 1940. As pessoas que utilizavam a coloração não eram descuidadas. Não tinham forma de saber o que havia no frasco.

A versão moderna do mesmo problema é uma especificação que descreve apenas parte do material. A conformidade com USP é a via para o mais elevado grau de pureza disponível no mercado, porque se trata de uma norma publicada completa e não de uma única medição: identidade, pureza, impurezas orgânicas incluindo os corantes azure, solventes residuais, impurezas elementares, resíduo após incineração, limites microbianos e endotoxinas bacterianas. A Blupreme obtém o seu azul de metileno junto de um fabricante farmacêutico e publica o certificado de análise completo, permitindo verificar cada linha dessa lista em vez de simplesmente a afirmar. Um certificado que apresenta um resultado de metais pesados e o designa como conformidade com USP é o equivalente atual de um frasco rotulado "azul de metileno maturado": possivelmente um bom reagente, mas o rótulo não lhe diz o que contém. :::