Interpretação de E. coli e de outras morfologias de colónias em ágar EMB

Um estudante semeia por estrias uma amostra desconhecida em ágar eosina-azul de metileno, incuba-a durante a noite e regressa para encontrar uma placa com colónias escuras e um brilho verde. No caderno lê-se "E. coli, confirmado." Essa anotação afirma mais do que a placa permite concluir. A placa mostra um fenótipo de crescimento e fermentação em condições específicas. A identidade da espécie é uma afirmação distinta que exige evidência própria.

Este guia aborda os resultados em ágar EMB como uma tarefa de interpretação. Explica o princípio subjacente, apresenta um atlas ilustrativo de placas com controlos e identifica os casos em que a imagem dos manuais pode induzir em erro.

O princípio por detrás da placa

O ágar EMB é simultaneamente seletivo e diferencial. Os corantes eosina Y e azul de metileno inibem muitos organismos Gram positivos, pelo que o meio favorece o crescimento de Gram negativos. Os mesmos corantes funcionam como indicadores: quando um organismo fermenta o açúcar disponível e produz ácido local suficiente, a colónia retém intensamente o corante e torna-se púrpura-escura a azul-negra. Com produção vigorosa de ácido, a superfície da colónia pode apresentar uma iridescência verde metálica. O protocolo da ASM para placas de ágar eosina-azul de metileno descreve esta combinação de seleção e diferenciação e fornece fotografias de referência para fins didáticos.

Há um pormenor importante antes de interpretar qualquer resultado: verificar qual a formulação utilizada. A formulação mais antiga de Holt Harris Teague contém lactose e sacarose, enquanto o EMB de Levine contém apenas lactose. Um organismo que fermente sacarose, mas não lactose, como acontece com muitos isolados de Serratia marcescens, pode apresentar um aspeto diferente nas duas versões. A documentação do fabricante para meios EMB indica explicitamente esta diferença de formulação. Registe no caderno o fabricante e a formulação juntamente com o resultado.

O ágar EMB preparado e não inoculado é geralmente castanho-avermelhado a púrpura-avermelhado, por vezes com uma tonalidade esverdeada ou um precipitado fino. Essa cor de fundo não corresponde a crescimento. Compare cada leitura com uma placa não inoculada ou com o valor de referência documentado e interprete a placa primária após cerca de 18 a 24 horas de incubação aeróbia a 35 a 37 C, salvo indicação em contrário no protocolo didático. Uma incubação prolongada pode alterar o aspeto da fermentação.

Como observar a placa

Utilize dois tipos de iluminação. Primeiro, observe a placa com luz refletida ou oblíqua e incline-a: o brilho metálico é iridescente e pode aparecer ou desaparecer consoante o ângulo de observação. Em seguida, examine-a com luz transmitida para avaliar a cor das colónias e os centros escuros. Trabalhe a partir de colónias bem isoladas, pois a aglomeração e as colónias vizinhas alteram a acumulação local de ácido e podem reduzir ou acentuar a cor. O conjunto de imagens da ASM demonstra diretamente este fenómeno: E. coli numa cultura mista pode perder o brilho esperado porque os organismos circundantes alteram o ambiente ácido.

Inclua controlos sempre que o exercício o permita. Um conjunto didático comum inclui E. coli ATCC 25922 para o fenótipo azul-negro com brilho metálico, um não fermentador como Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ou Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 para o fenótipo incolor e um Gram positivo como Enterococcus faecalis ou Staphylococcus aureus como controlo de inibição, conforme indicado nas tabelas-padrão de controlo de qualidade para meios EMB. Se o controlo positivo não apresentar brilho, suspeite da incubação, da aglomeração ou da formulação antes de suspeitar da amostra desconhecida.

Atlas ilustrativo de placas

As placas abaixo são ilustrações geradas, não fotografias de culturas reais. Mostram o padrão a procurar, não a tonalidade exata de uma determinada estirpe. Compare-as com as fotografias de referência da ASM e com placas reais do laboratório de ensino.

Placa 1: Escherichia coli em ágar EMB, fermentador vigoroso de lactose

E. coli em ágar EMB é normalmente púrpura-escura a azul-negra, frequentemente com um centro escuro e um brilho verde metálico resultante da produção vigorosa de ácido. O brilho é o achado conhecido que os estudantes procuram, mas deve ser tratado como evidência de suporte e não como uma definição. A intensidade do brilho varia consoante a estirpe, o tempo de incubação, a densidade das colónias e o ângulo de observação. A ausência de brilho não exclui E. coli, e uma colónia escura sem brilho pode corresponder a vários outros fermentadores. Para qualquer trabalho subsequente, selecione uma colónia bem isolada em vez de interpretar uma zona densamente povoada.

Placa 2: Klebsiella pneumoniae em ágar EMB, fermentador mucóide

Klebsiella pneumoniae em ágar EMB forma normalmente colónias grandes, brilhantes e mucóides, em tonalidades de cor-de-rosa-púrpura a castanho-púrpura, frequentemente com centros escuros, mas geralmente sem brilho metálico intenso. Uma morfologia semelhante ocorre em fermentadores relacionados, como Enterobacter. A textura mucóide e o tamanho da colónia fazem parte da interpretação: uma colónia cor-de-rosa pequena e plana tem um significado diferente de uma colónia mucóide grande e abaulada. Tal como acontece com E. coli, a placa sugere um fenótipo de fermentação, e a identificação ao nível da espécie requer a confirmação bioquímica descrita abaixo.

Placa 3: Salmonella em ágar EMB e outros não fermentadores, colónias incolores

Salmonella em ágar EMB e outros organismos relacionados que não fermentam lactose, incluindo Shigella e muitos isolados de Pseudomonas, crescem normalmente como colónias incolores a translúcidas ou de tom âmbar pálido. Algumas formulações e condições produzem uma ligeira tonalidade rosada, pelo que uma colónia cor-de-rosa pálida não é automaticamente um fermentador. O EMB não distingue Salmonella de Shigella nem de outros não fermentadores; essa distinção pertence a testes posteriores. Note também que estão documentadas estirpes de Salmonella positivas para lactose com colónias metálicas semelhantes às de E. coli, o que constitui mais uma razão para uma única placa não permitir encerrar a identificação.

Placa 4: Serratia marcescens e a armadilha da formulação

Serratia marcescens merece uma secção própria porque os estudantes esperam frequentemente colónias vermelhas e acabam por interpretar mal a placa. A maioria dos isolados clínicos não fermenta lactose, pelo que no EMB de Levine aparecem habitualmente pálidos ou fracamente coloridos. Como muitos isolados fermentam sacarose, uma formulação que contenha sacarose pode produzir uma reação mais escura ou mais associada à produção de ácido. Também não se deve esperar o pigmento vermelho clássico prodigiosina a 35 a 37 C; a produção de pigmento é pouco fiável à temperatura de incubação. Quando o protocolo menciona Serratia marcescens em ágar EMB, verifique qual a formulação pressuposta. Uma revisão do metabolismo de Serratia resume o padrão de lactose negativa e sacarose variável que está na origem desta armadilha.

Placa 5: controlos e organismos inibidos

Organismos Gram positivos como Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus e Bacillus são geralmente inibidos ou fortemente suprimidos em ágar EMB, embora a inibição não seja absoluta para todas as estirpes. Um painel de controlo torna a interpretação mais rigorosa: o controlo de E. coli deve apresentar bom crescimento, coloração azul-negra e brilho, o controlo do não fermentador deve apresentar crescimento incolor e o controlo de inibição deve apresentar pouco ou nenhum crescimento. Se o controlo de inibição crescer bem, a etapa seletiva falhou e todas as restantes leituras desse lote ficam sob suspeita. Os métodos de coloração respondem a uma pergunta diferente dos meios de cultura; para a vertente de coloração em lâmina no laboratório, consulte o atlas de coloração com azul de metileno.

Comparação delimitada

Três frases resumem os aspetos que podem induzir em erro. Escuro não significa E. coli, pois Klebsiella, Enterobacter e outros fermentadores desenvolvem centros escuros sem brilho. Cor-de-rosa não significa Klebsiella, pois fermentadores moderados ou lentos e alguns organismos habitualmente classificados como não fermentadores podem parecer cor-de-rosa ou lavanda. Brilho não significa E. coli de forma definitiva, pois outros fermentadores vigorosos também o podem produzir. O protocolo didático e as respetivas figuras de culturas mistas ilustram cada uma destas limitações.

Limites da confirmação

O ágar EMB revela um fenótipo, não uma espécie. Organismos diferentes podem partilhar o mesmo aspeto de colónia, e um único organismo pode afastar-se da imagem apresentada nos manuais consoante a estirpe, a idade, a aglomeração, a formulação e a incubação. É por isso que os fluxos de trabalho didáticos e clínicos tratam a morfologia em EMB como presuntiva.

Um fluxo de trabalho defensável para um estudante consiste em: descrever a colónia isolada (tamanho, cor, centro, brilho sob luz oblíqua, caráter mucóide), registar a formulação, o tempo e a temperatura de incubação e os controlos; em seguida, subcultivar uma colónia bem isolada até obter uma cultura pura antes de qualquer teste de confirmação. Os testes subsequentes comuns incluem coloração de Gram mais reações IMViC para a identificação presuntiva de E. coli e coliformes, TSI ou KIA e painéis bioquímicos específicos do organismo para organismos entéricos, recorrendo a métodos serológicos, MALDI TOF ou outros métodos de identificação validados quando a tarefa assim o exige. Para compreender como o EMB se enquadra entre os meios seletivos e diferenciais para organismos entéricos, consulte introduções aos meios de cultura entéricos e ao seguimento com coloração de Gram. Para a questão relacionada do que uma coloração azul numa lâmina pode ou não demonstrar, o atlas de coloração com azul de metileno mantém a observação e a conclusão separadas segundo o mesmo princípio.

Registe a observação antes da conclusão. "Colónias azul-negras escuras com brilho verde dependente do ângulo em EMB de Levine às 24 horas, compatíveis com fermentação vigorosa da lactose" é uma formulação defensável. "E. coli, confirmado" exige a etapa de confirmação que a placa, por si só, não consegue fornecer. :::