Ensaios de azul de metileno em levedura: contagem de células vivas versus tempo de respiração

Dois tubos estão sobre a bancada. Ambos são azuis. Num deles, células azuis ao microscópio significam levedura morta. No outro, um tubo que passa de azul a incolor significa que a levedura está viva e a respirar. O mesmo corante, leituras opostas. Confundir os dois ensaios inverte todas as conclusões.

Esta distinção é o tema central de todo o artigo. O azul de metileno é um corante redox: na forma oxidada é azul, e na forma reduzida é azul de leucometileno incolor. Uma contagem de viabilidade tira partido desta química numa observação microscópica breve. Uma experiência de respiração utiliza-a numa reação global temporizada. Cada uma exige o seu próprio protocolo, os seus próprios controlos e o seu próprio grau de ceticismo.

A contagem de viabilidade: uma coloração breve, lida rapidamente

O protocolo usado em cervejaria é a versão mais normalizada. Prepare azul de metileno a 0.01% w/v em citrato de sódio a 2%, misture-o 1:1 com a suspensão de levedura e examine a mistura após um intervalo curto e fixo. Os intervalos publicados variam entre 1 e 2 minutos no manual do Brewing Science Institute e cerca de 5 minutos em protocolos de investigação, enquanto o método de microbiologia do vinho da OIV exige que a observação seja realizada no prazo de 10 minutos. Na mistura usada para a contagem, o corante fica a uma concentração próxima de 0.005%. Carregue uma câmara de Neubauer melhorada e, a cerca de 400x, classifique as células azul-escuras como não viáveis e as células não coradas como viáveis. No método da OIV, as células azul-claras são classificadas como vivas, o que já antecipa o problema de subjetividade discutido abaixo.

A concentração celular deriva da geometria da câmara. Quando é contado todo o quadrado central de 1 mm, as células por mL são iguais a N vezes o fator de diluição vezes 10^4, em que N é a contagem nessa área, conforme descrito nos métodos de levedura da ASBC. A viabilidade é mais simples: células não coradas divididas pelo total de células, vezes 100. Conte cerca de 400 células para obter uma estimativa da viabilidade, seguindo o estudo comparativo da FEMS em cervejaria e a prática da OIV. Utilize de forma consistente uma única regra de fronteira, por exemplo incluindo as células sobre as linhas inferior e esquerda da grelha e excluindo as que estão sobre as linhas superior e direita.

É necessário definir uma regra para os brotos antes de iniciar a contagem. Uma convenção comum consiste em contar um broto como célula separada quando atinge cerca de metade do tamanho da célula-mãe, e juntamente com a mãe enquanto estiver abaixo desse tamanho. Qualquer que seja a regra escolhida, aplique-a a todos os quadrados e registe-a na ficha para que a pessoa seguinte a possa repetir.

Ficha de contagem (imprima esta)

Esta ficha é um recurso original deste artigo. Copie-a para um caderno ou imprima uma por amostra.

Viabilidade (%) = 100 x não coradas / (não coradas + azul-escuras). Total de células por mL = N x fator de diluição x 10^4, com N obtido a partir da área definida da câmara. Registe o intervalo de coloração junto ao resultado, porque um valor de viabilidade sem a respetiva temporização não é reprodutível.

Porque variam os valores de viabilidade

A temporização é a primeira interferência e atua nos dois sentidos. As células metabolicamente ativas reduzem o corante, pelo que uma leitura demasiado precoce pode observar células vivas antes de estas terminarem de o reduzir e classificá-las incorretamente como mortas. No entanto, uma exposição prolongada é, por si só, tóxica e cria células azuis genuinamente danificadas, produzindo uma falsa indicação de morte. Por isso, um protocolo laboratorial de ensino especifica que a classificação deve ser feita no prazo de 5 minutos, conforme documentado num protocolo de ensino sobre levedura da Wisconsin. A formulação mais segura é que a classificação com azul de metileno depende do tempo, pelo que se deve fixar um intervalo curto e mantê-lo constante em todas as amostras de uma série.

As amostras com baixa viabilidade apresentam um segundo viés. O método normalizado alerta que o azul de metileno pode sobrestimar a viabilidade real abaixo de cerca de 80%, porque células que ainda conseguem reduzir o corante não mantêm necessariamente capacidade reprodutiva. A literatura cervejeira descreve a mesma falta de fiabilidade quando a viabilidade está substancialmente degradada. Considere o azul de metileno uma estimativa rápida e aproximada e confirme decisões críticas em situações de baixa viabilidade, como a reinoculação de uma cultura, através de contagens em placa ou de uma coloração complementar.

Os efeitos da matriz surgem em terceiro lugar. O método da OIV é realizado perto de pH 4.6 e alerta que amostras fortemente tamponadas com pH baixo impedem o comportamento correto do corante, recomendando também que o ensaio não seja utilizado acima de 100 g/L de açúcar, condição em que as células apresentam uma coloração azul-clara enganadora. Uma comparação experimental do pH de coloração encontrou alterações substanciais da sensibilidade ao longo do intervalo testado, em concordância com um estudo do método do azul de metileno dependente do pH. Os detritos constituem outra armadilha: partículas coradas em mostos sujos imitam células mortas e aumentam a variabilidade entre operadores.

Essa variabilidade está quantificada, não é apenas anedótica. Num ensaio de seis meses numa cervejaria, referido na comparação de levedura da FEMS, medições duplicadas com azul de metileno apresentaram em média um desvio-padrão de 6.1%, em comparação com 0.2% para citometria de fluxo com oxonol, e dois operadores diferiram até 13 pontos percentuais na mesma amostra. Uma comparação quantitativa de métodos de viabilidade de 2023 concluiu que a microscopia de fluorescência e a citometria de fluxo eram substancialmente mais precisas, mostrando simultaneamente que o desempenho depende da espécie e da matriz. A descrição clássica do método por Painting e Kirsop (PMID 24430080) continua a ser uma referência, e uma revisão mais abrangente dos ensaios de viabilidade e vitalidade da levedura (PMID 25154541) coloca o azul de metileno entre os testes complementares, e não entre os definitivos. O azul de tripano não é uma melhoria automática neste contexto: indica perda de integridade da membrana, enquanto o azul de metileno indica captação juntamente com atividade redutora, pelo que células sob stress podem ser classificadas de forma diferente pelos dois corantes.

A experiência de respiração: medir o tempo até o azul desaparecer

O segundo ensaio não utiliza microscópio. Levedura, glucose e azul de metileno diluído são colocados num tubo fechado, e mede-se quanto tempo demora o azul a desaparecer. À medida que as células metabolizam, geram equivalentes redutores que convertem o corante azul na sua forma incolor, enquanto o oxigénio dissolvido volta a oxidá-lo. Quando as células reduzem suficientemente o oxigénio disponível, a redução líquida passa a predominar e o tubo descolora. O ponto final reflete, portanto, o equilíbrio entre respiração, concentração do corante e disponibilidade de oxigénio, devendo ser comunicado como tempo de redução ou de descoloração do azul de metileno, e não como uma taxa direta de consumo molecular de oxigénio.

Utilize um corante muito mais diluído do que nos ensaios de viabilidade para que a medição decorra numa janela de tempo conveniente. O manual de práticas obrigatórias do AQA A level normaliza bem este procedimento: 1 g de glucose por 100 mL de água aquecida a cerca de 30 C, 5 g de levedura seca adicionada imediatamente antes da utilização e uma solução de trabalho do corante próxima de 0.001%, preparada diluindo 0.1 mL de uma solução-mãe a 1% até 100 mL. Misture 2 mL de suspensão de levedura e glucose com 2 mL da solução de trabalho do corante, equilibre à temperatura de ensaio, agite uma vez durante 10 segundos, inicie o cronómetro e não volte a agitar. A agitação reintroduz oxigénio e volta a tornar o tubo azul, constituindo o maior artefacto do procedimento. A AQA indica que a preparação deverá normalmente descolorar em cerca de 5 minutos a 35 C, com médias experimentais de 275 s a 20 C, 128 s a 35 C e 145 s a 45 C. Estes valores são exemplos de uma única configuração, não referências universais. A relação quantitativa entre a taxa de redução e a levedura metabolicamente ativa em condições controladas é sustentada por estudos específicos de redução, incluindo trabalhos indexados como PMID 25773544 e o estudo mecanístico publicado em Yeast (2014).

Demonstração da evolução temporal (recurso original)

A tabela abaixo é uma demonstração original produzida para este artigo utilizando a configuração ao estilo AQA descrita acima: 2 mL de mistura de levedura e glucose mais 2 mL de solução de trabalho do corante próxima de 0.001%, uma agitação de 10 segundos e, em seguida, incubação sem perturbação. As entradas são leituras de exemplo no formato que um grupo de estudantes deverá registar, com o índice de velocidade definido como 1 dividido pelo tempo de descoloração em segundos. Execute os mesmos tubos e substitua estas entradas pelos valores medidos.

Represente graficamente o índice de velocidade em função da temperatura para os tubos A, B e C. A curva sobe e depois estabiliza ou desce, que é o padrão esperado para um processo impulsionado por enzimas, e não uma linha reta. Os tubos D, E e F não são pontos de dados dessa curva. São os controlos que permitem interpretar a curva.

Controlos que dão significado a cada ensaio

Cada ensaio de respiração necessita de três acompanhamentos. Levedura fervida ou morta mais glucose mais corante deverá permanecer azul, demonstrando que a redução rápida depende do metabolismo de células vivas. Levedura viva mais corante sem adição de glucose funciona como controlo de substrato, mas ainda assim é de esperar uma descoloração lenta, uma vez que a levedura consome reservas endógenas. Glucose mais corante sem levedura constitui o branco químico, essencial porque a glucose alcalina pode reduzir o azul de metileno sem qualquer célula presente.

A contagem de viabilidade necessita de outro tipo de controlo: constância do procedimento. A mesma solução-mãe de corante, a mesma proporção de mistura, o mesmo intervalo de coloração, a mesma área da câmara, as mesmas regras para brotos e fronteiras e, sempre que possível, uma contagem em condições cegas. Quando dois operadores diferem em dez pontos, a ficha geralmente revela a causa: tempos diferentes, limiares de azul diferentes ou regras diferentes para os brotos. As técnicas de preparação e observação de células coradas estão relacionadas com os métodos simples de coloração bacteriana, enquanto uma visão mais abrangente do que o corante marca em diferentes amostras se encontra no atlas de coloração para microscopia. Para compreender a física subjacente à leitura quantitativa de qualquer intensidade de azul, a condição identificada como referência de absorção explica por que razão cada coeficiente deve ser acompanhado pelas respetivas condições de solvente, pH e concentração.

Escolha o ensaio de acordo com a pergunta. Quantas células estão vivas neste momento é uma questão de contagem, respondida ao microscópio com uma ficha de registo. Quão ativamente esta cultura está a respirar é uma questão cinética, respondida com um cronómetro e tubos controlados. O azul de metileno serve para ambos, mas nunca no mesmo tubo ao mesmo tempo.