Azul de metileno e sinalização inflamatória: inflamassomas, IL-6 e STAT3

Suponha que três laboratórios comuniquem que o mesmo composto azul é anti-inflamatório. Um mostra menos IL-1beta proveniente de macrófagos. Outro mostra menos enzima iNOS no mesmo tipo celular. Outro mostra menos IL-6 no sangue e menor atividade de STAT3 no cérebro. A tentação é fundir os três resultados numa única afirmação. Essa fusão esconde a descoberta.

Cada resultado pertence a um conceito de sinalização diferente, com o seu próprio estímulo, etapa de montagem e parâmetro de leitura. O azul de metileno intervém em cada conceito num ponto diferente. Saber se alguma destas alterações melhora um resultado de saúde é uma questão distinta, abordada na nossa visão geral do azul de metileno e da inflamação. Esta página limita-se às vias.

Via 1: montagem do inflamassoma e caspase-1

Um inflamassoma é uma estrutura proteica montada conforme necessário no interior de uma célula mieloide. Os seus componentes são um sensor, um adaptador denominado ASC e uma enzima efetora denominada caspase-1. Depois de montada, a caspase-1 cliva pro-IL-1beta e pro-IL-18 nas respetivas formas secretadas e pode desencadear piroptose, uma forma inflamatória de morte celular. O sensor define o tipo: NLRP3 responde a cristais e toxinas formadoras de poros, como nigericina e ATP, NLRC4 responde à flagelina bacteriana, AIM2 responde a DNA de cadeia dupla citosólico e a via não canónica responde a lipopolissacarídeo intracelular.

A ativação requer dois sinais. O primeiro sinal é a preparação: um ligando de um receptor do tipo Toll induz a transcrição dependente de NF-kB de NLRP3 e pro-IL-1beta para que os componentes estejam disponíveis. O segundo sinal é a montagem: um segundo estímulo faz com que ASC oligomerize formando specks, que a caspase-1 seja clivada no seu fragmento p20 e que IL-1beta p17 madura seja libertada. As espécies reativas de oxigénio mitocondriais e a captação de cristais são contribuintes conhecidos para o segundo sinal de NLRP3.

O estudo de 2017 em macrófagos sobre a inibição ampla de inflamassomas testou o azul de metileno em ambos os sinais. Em macrófagos de medula óssea de ratinho preparados com lipopolissacarídeo, nigericina, ATP e cristais de urato monossódico induziram, cada um, a libertação de IL-1beta e caspase-1, além da formação de specks de ASC, e o azul de metileno a 20 a 200 micromolar reduziu os três de forma dependente da dose sem matar as células. Flagelina e Salmonella para NLRC4, DNA de cadeia dupla e Listeria para AIM2, e lipopolissacarídeo transfectado ou E. coli viva para a via não canónica mostraram o mesmo padrão. O composto isoladamente não desencadeou libertação, e as placas de controlo não mostraram qualquer efeito antibacteriano, pelo que o resultado diz respeito à resposta do hospedeiro.

A montante, foram medidas três intervenções. O superóxido mitocondrial induzido por rotenona diminuiu com o azul de metileno, tal como a libertação de IL-1beta induzida por rotenona. A captação de microesferas fluorescentes diminuiu, em consonância com uma redução da fagocitose antes da deteção de cristais. Um repórter controlado pelo promotor de NLRP3 com dois locais NF-kB apresentou menor atividade com azul de metileno, enquanto um promotor truncado sem esses locais não respondeu. Num tubo sem células, o azul de metileno também reduziu diretamente a atividade da caspase-1 humana recombinante. A adição do composto apenas durante a preparação ou apenas durante a ativação continuou a reduzir a libertação de IL-1beta, IL-18 e caspase-1, pelo que ambas as etapas estão envolvidas.

Os testes em ratinhos corresponderam a esta seletividade. Uma dose letal de lipopolissacarídeo matou os controlos em poucas horas, enquanto o azul de metileno melhorou a sobrevivência; a IL-1beta peritoneal diminuiu, mas a IL-6 no mesmo fluido não. Num modelo de peritonite por Listeria, a IL-1beta peritoneal diminuiu, enquanto a contagem total de células permaneceu inalterada. Os monócitos humanos THP-1 comportaram-se como os macrófagos de ratinho nos quatro tipos de inflamassoma. Um resultado relativo ao inflamassoma explica a maturação de IL-1beta e IL-18, não de todas as citocinas, razão pela qual a morfologia das células imunitárias cerebrais em experiências com microglia e astrócitos responde a uma questão diferente da montagem da estrutura.

Via 2: transcrição de iNOS através da ligação de NF-kB e STAT1

A sintase induzível do óxido nítrico, ou iNOS, está praticamente ausente em repouso e é transcrita conforme necessário. O lipopolissacarídeo induz a sua expressão sobretudo através da degradação de IkB-alpha, seguida da fosforilação de NF-kB e da entrada no núcleo. O interferon-gamma induz a sua expressão sobretudo através da fosforilação de STAT1 pela cinase Janus, seguida da entrada de STAT1 no núcleo. Cada fator liga-se depois ao respetivo local no promotor de iNOS. A atividade enzimática e a indução génica são pontos de controlo distintos, e um fármaco pode atuar num deles ou em ambos.

O estudo de 2015 sobre a indução de iNOS em macrófagos e ratinhos endotoxémicos localizou o efeito ao nível da mensagem. Em células RAW 264.7 e macrófagos primários de ratinho, 1 micromolar de azul de metileno administrado 30 minutos antes de lipopolissacarídeo, interferon-gamma ou ambos reduziu a proteína e o mRNA de iNOS ao longo de 8 a 24 horas, com menor concentração de nitrito no meio e sem perda de viabilidade. Em ratinhos que receberam 25 mg per kg de lipopolissacarídeo, uma única dose de 5 mg per kg administrada uma hora antes reduziu a proteína e o mRNA de iNOS no pulmão, fígado e coração.

O detalhe distintivo é aquilo que não mudou. A degradação de IkB-alpha, a fosforilação de NF-kB, a fosforilação de STAT1 e a acumulação nuclear de qualquer dos fatores permaneceram intactas. A interrupção ocorreu uma etapa depois: os extratos nucleares mostraram menor ligação de NF-kB ao respetivo elemento de DNA após lipopolissacarídeo e menor ligação de STAT1 após interferon-gamma, e a imunoprecipitação da cromatina confirmou menor ocupação por qualquer dos fatores no promotor de iNOS dentro das células. O fator de necrose tumoral alpha, cujo promotor também utiliza NF-kB, também diminuiu. Os fatores foram ativados e chegaram ao local, mas ligaram-se de forma deficiente ao DNA-alvo.

Note-se o contraste com a via 1. Aqui está em causa a interação entre fator e DNA, utiliza-se STAT1 em vez de STAT3 e medem-se mRNA, proteína e nitrito em vez de specks de ASC e fragmentos de caspase-1. O nosso mapa dos alvos do azul de metileno em diferentes modelos celulares mantém este nível transcricional separado das medições diretas de enzimas e mitocôndrias.

Via 3: IL-6 sérica e ativação de STAT3 nos tecidos

A IL-6 sinaliza através da família de recetores gp130 para a cascata da cinase Janus até STAT3. STAT3 fosforilada dimeriza, entra no núcleo e induz programas inflamatórios, enquanto a própria IL-6 é um alvo de NF-kB, pelo que as duas formam um ciclo de feedback frequentemente denominado eixo IL-6 para STAT3. Os parâmetros de leitura padrão são a IL-6 sérica a montante, a razão entre STAT3 fosforilada e STAT3 total e enzimas efetoras como iNOS e COX2 a jusante.

O estudo de 2023 em ratinhos sobre IL-6 e STAT3 após lipopolissacarídeo mediu o eixo em vários compartimentos. Ratinhos machos C57BL/6 receberam 1 mg per kg de lipopolissacarídeo diariamente durante três dias, com 5 ou 10 mg per kg de azul de metileno 30 minutos após cada dose. No terceiro dia, a IL-6 sérica era mais baixa em ambos os grupos de azul de metileno do que com lipopolissacarídeo isoladamente, enquanto a maioria das outras citocinas do painel não se alterou com o tratamento. As razões entre STAT3 fosforilada e STAT3 total eram mais baixas no córtex, hipocampo e pele da orelha, com menor marcação microglial por Iba-1, menores níveis de iNOS e COX2 e perda de peso parcialmente atenuada.

Há aqui duas ressalvas. Uma IL-6 sérica mais baixa juntamente com menor fosforilação de STAT3 nos tecidos é compatível com modulação do eixo, mas não permite isolar o ponto primário, uma vez que uma menor quantidade de citocina a montante, menor sinalização do recetor ou alteração da atividade das fosfatases poderiam produzir a mesma razão. Além disso, o peso ao longo de três dias de desafio agudo é um parâmetro de leitura do organismo inteiro, não uma pontuação de sintomas ou remissão. Acrescenta contexto para além de um blot sem transformar um resultado de sinalização numa alegação terapêutica. A química distinta do controlo redox mitocondrial ocorre em paralelo com este mecanismo de citocinas e não deve ser fundida com ele.

Comparação das vias: pontos de intervenção e parâmetros de leitura

A tabela impede três extrapolações inválidas. Um resultado relativo a specks de ASC não demonstra um resultado relativo a STAT3. Um resultado de STAT1 no promotor de iNOS não demonstra um resultado relativo a STAT3, embora ambas as proteínas pertençam à família STAT. Um resultado de IL-6 sérica não demonstra redução da montagem do inflamassoma: na experiência peritoneal, IL-1beta diminuiu enquanto IL-6 não diminuiu. Cada linha necessita do seu próprio estímulo e parâmetro de leitura, razão pela qual a leitura de estudos celulares, animais e clínicos sobre azul de metileno exige que cada afirmação seja associada ao nível efetivamente medido.

Nada disto estabelece dosagem, segurança ou benefício em pessoas. Os modelos com lipopolissacarídeo utilizam estímulos controlados para testar um mecanismo, não são réplicas de doença crónica, e a administração junto do estímulo testa a prevenção de uma alteração induzida, em vez da reversão de uma doença estabelecida. Este relato mecanístico deve permanecer separado dos resultados em doentes, e qualquer alegação de saúde deve ser avaliada com base no estudo em doentes que a sustenta. :::