Azul de metileno e progeria: lições de um modelo celular de envelhecimento

Uma alteração de uma única letra num gene faz com que as crianças envelheçam a uma velocidade assustadora. Queda de cabelo, articulações rígidas, artérias estreitadas e uma esperança de vida que não vai muito além da adolescência. Essa doença é a síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford e, durante anos, a investigação centrou-se no núcleo, onde a proteína mutante causa os seus danos. Um estudo de 2016 da Universidade de Maryland colocou uma questão diferente: como são as mitocôndrias nestas células? A resposta ligou dois compartimentos da célula, e um corante azul com um século de história atuou sobre ambos.

O estudo é de Xiong e colegas, publicado na Aging Cell em 2016. Foi realizado inteiramente com células cultivadas. Esse facto enquadra tudo o que se segue. Os resultados são reais e específicos. A distância que os separa de qualquer tratamento é igualmente específica.

O modelo: uma mutação, uma proteína aderente

A progeria começa com uma substituição de C por T na posição 1824 do gene LMNA. A alteração não modifica um aminoácido. Ativa um local de splicing oculto, o que elimina 50 aminoácidos da proteína lamina A. O produto encurtado, chamado progerina, perde o local de clivagem que normalmente permitiria à célula remover a sua âncora farnesil. Assim, a progerina permanece permanentemente farnesilada e presa à membrana nuclear interna, onde a lamina A normal entraria e sairia ciclicamente.

As consequências no núcleo estão bem documentadas e são visíveis ao microscópio. Os núcleos formam saliências e enrugam-se, em vez de manterem uma forma oval lisa. A heterocromatina, o DNA silencioso densamente compactado que normalmente reveste a periferia nuclear, torna-se menos abundante. Milhares de genes alteram a sua expressão. Pense na lâmina nuclear como uma estrutura de suporte por trás de papel de parede: quando uma das peças da estrutura fica soldada na posição errada, a parede abaula e o padrão do papel deforma-se em toda a divisão.

O estudo utilizou fibroblastos cutâneos de doentes com progeria juntamente com células de controlo correspondentes em número de passagens, além de uma segunda linha modificada para que fibroblastos normais produzissem diretamente progerina. As células modificadas desenvolveram os mesmos defeitos, o que atribui a causa à progerina e não ao historial dos doentes nem ao tempo em cultura. A gravidade acompanhou a dose: a linha que expressava mais progerina apresentou defeitos mais acentuados em todo o estudo.

Como eram as mitocôndrias

As mitocôndrias de fibroblastos saudáveis formam uma rede ramificada em torno do núcleo, composta por túbulos longos que percorrem as estruturas do citoesqueleto. Nas linhas de progeria, essa rede tinha desaparecido. Uma fração maior das mitocôndrias estava fragmentada, muitas encontravam-se inchadas e a microscopia eletrónica mostrou um aumento de aproximadamente duas vezes no número de organelos gravemente danificados. A imagiologia em lapso de tempo mostrou que percorriam distâncias menores a velocidades inferiores às dos controlos.

A função acompanhou a forma. Os níveis de superóxido mitocondrial e de oxidantes em toda a célula aumentaram. Mais células apresentaram potencial de membrana perturbado. A produção de ATP diminuiu. Isoladamente, nada disto é surpreendente, uma vez que mitocôndrias danificadas libertam espécies reativas de oxigénio e produzem menos energia. A novidade foi a causa proposta. A PGC-1alpha, o coativador transcricional que impulsiona a biogénese mitocondrial através de fatores a jusante como NRF1, TFAM e os reguladores de fusão e fissão MFN1, MFN2, OPA1, FIS1 e DRP1, estava suprimida cerca de oito vezes ao nível do mRNA nas células de progeria, com uma redução correspondente da proteína. A progerina parecia estar a reprimir o interruptor principal da produção e manutenção das mitocôndrias. Esta ligação entre danos na lâmina nuclear e metabolismo energético faz parte do quadro mais amplo da produção mitocondrial de energia, e o lado oxidante do mesmo equilíbrio é abordado no controlo do stress oxidativo e das ROS.

O que o azul de metileno alterou

Os investigadores trataram as células continuamente durante semanas com 100 nanomolar de azul de metileno, uma concentração baixa. Em termos de cultura celular, trata-se de uma exposição prolongada e ligeira, não de uma administração breve do fármaco. O azul de metileno alterna entre formas oxidada e reduzida e pode transportar eletrões no interior das mitocôndrias, razão pela qual é descrito como um composto redox direcionado às mitocôndrias, e não como um antioxidante comum que é consumido ao neutralizar um oxidante.

As mitocôndrias responderam tanto nas células normais como nas células de progeria. O ATP aumentou, os níveis de oxidantes diminuíram e a fração de mitocôndrias gravemente defeituosas reduziu-se. A expressão de PGC-1alpha recuperou parcialmente, juntamente com alguns dos seus alvos a jusante. Até este ponto, trata-se de um efeito geral de suporte mitocondrial, não específico da progeria.

Os resultados nucleares foram a surpresa, e eram específicos das células afetadas pela doença. A formação de saliências nucleares diminuiu segundo uma análise quantitativa da forma. As quantidades totais de laminas A e C aumentaram. Mais impressionante ainda, a progerina redistribuiu-se: nas células de progeria não tratadas, apenas cerca de 30 por cento da progerina se encontrava na fração nucleoplasmática solúvel, permanecendo o restante ancorado à membrana. Após o tratamento, a fração solúvel aumentou para aproximadamente 65 por cento, aproximando-se do comportamento normal das laminas. Libertada da membrana, a progerina arrasta consigo menos proteínas vizinhas, e as frações solúveis das laminas A e C também recuperaram.

A jusante dessa libertação, dois fenótipos nucleares melhoraram. A heterocromatina perinuclear, examinada por microscopia eletrónica e por coloração da proteína de heterocromatina HP1-alpha, foi visivelmente restaurada. Além disso, a sequenciação de RNA mostrou o transcriptoma a aproximar-se novamente do normal: as células de progeria não tratadas diferiam dos controlos em mais de 3,200 genes, enquanto as células de progeria tratadas diferiam em cerca de 1,670. Nas células normais, o mesmo tratamento alterou apenas algumas dezenas de genes, o que sugere que o efeito nuclear está ligado à progerina, em vez de representar uma perturbação transcricional generalizada. O princípio de que as preparações celulares e animais respondem a perguntas mais restritas do que os respetivos títulos podem sugerir é explicado em como ler investigação sobre azul de metileno.

Por que motivo isto não é um tratamento

Quatro limitações mantêm este estudo no lugar a que pertence: dentro do laboratório.

Primeiro, tudo aconteceu em placas de cultura. Os fibroblastos em cultura não têm irrigação sanguínea, contexto imunitário, arquitetura tecidular nem a farmacologia de todo o organismo que determina se um composto chega sequer ao seu alvo. Neste artigo, nenhum animal recebeu uma dose e nenhum doente foi tratado.

Segundo, os fibroblastos de progeria são um modelo de um único tipo celular. A doença causa mortalidade sobretudo através das artérias, dos ossos e do tecido adiposo, e o estudo avaliou apenas fibroblastos, além de uma preparação de músculo liso. Outros tecidos podem comportar-se de forma diferente.

Terceiro, a recuperação nuclear resultou de semanas de exposição contínua a concentrações nanomolares em meio de cultura. As concentrações numa placa não são doses, e nada no artigo converte 100 nanomolar no meio num regime para seres humanos. O azul de metileno tem a sua própria relação dose-resposta e perfil de segurança noutros contextos médicos, e este estudo não fornece qualquer fundamento para utilização doméstica. O contexto geral de segurança é abordado em segurança e efeitos secundários do azul de metileno.

Quarto, a progeria não é envelhecimento normal. É uma doença rara causada por uma única mutação, na qual a estrutura de suporte nuclear falha de uma forma específica. O facto de um composto atenuar essa alteração específica em células cultivadas diz pouco sobre o envelhecimento em pessoas sem a mutação. O fenótipo celular oferece uma perspetiva sobre a comunicação entre núcleo e mitocôndrias, não um resultado sobre longevidade.

O resumo adequado é, portanto, condicional. Nos fibroblastos de progeria, a progerina suprime a PGC-1alpha e deixa as mitocôndrias fragmentadas, lentas, com excesso de oxidantes e com défice energético. O azul de metileno em baixa concentração restaurou indicadores mitocondriais em todas as células e, adicionalmente, libertou a progerina da membrana nuclear nas células afetadas pela doença, com recuperação parcial da forma nuclear, da heterocromatina e da expressão génica. Essa ação dupla torna o estudo relevante. Não transforma o azul de metileno numa terapia para a progeria nem para o envelhecimento.