Azul de metileno e ELA: porque os resultados diferem entre modelos experimentais

Ao pesquisar azul de metileno e ELA, surgem duas afirmações que parecem contradizer-se. Uma diz que o corante azul protegeu neurónios em modelos de ELA. A outra diz que não teve qualquer efeito num ratinho com ELA. Ambas as afirmações citam artigos reais, e ambos os artigos merecem ser levados a sério. A contradição desaparece quando se explicita o conceito subjacente a cada experiência: a afirmação é limitada ao modelo.

Um resultado num verme é uma afirmação sobre um verme. Um resultado num peixe em fase larvar é uma afirmação sobre um peixe em fase larvar. Nenhum dos dois é uma afirmação sobre um doente até que a evolução da doença num mamífero o demonstre. Este artigo compara lado a lado os dois trabalhos mais citados para mostrar porque é que as respostas diferem.

As duas experiências numa tabela

Mantenha esta tabela disponível enquanto lê. Todas as diferenças importantes entre os estudos estão resumidas nela.

A genética difere, as espécies diferem, a via de administração difere, o momento da administração difere e os desfechos diferem. O genótipo é apenas uma de cinco diferenças, pelo que este par de estudos não pode demonstrar que o azul de metileno atua seletivamente numa determinada via da ELA. Demonstra algo mais restrito, mas ainda útil: uma recuperação acentuada sob exposição direta e precoce em modelos simples não se reproduziu durante a evolução crónica da doença num mamífero tratado por via oral.

O resultado positivo: o que mostrou o estudo em vermes e peixes

O estudo de 2012 em vermes e peixes expressou TDP-43 ou FUS humano mutante nos neurónios motores dos vermes e injetou mRNA humano mutante em embriões de peixe. Estes são modelos de proteotoxicidade. Reproduzem, ao longo de dias, os efeitos tóxicos da proteína mutante sobre o movimento e a forma dos neurónios, e não a evolução completa da ELA humana adulta ao longo de anos.

O tratamento começou muito cedo. Os vermes cresceram desde a eclosão em ágar contendo azul de metileno. Os embriões de peixe permaneceram durante a noite numa solução com o composto, a partir das 24 horas após a fertilização, e o comportamento foi testado cerca de dois dias depois. Não existia uma barreira hematoencefálica entre o composto e o neurónio da mesma forma que existe num mamífero, e não foram medidos os níveis do composto no plasma ou no cérebro.

Nessas condições, os efeitos foram grandes e consistentes. Tanto 6 como 60 μM reduziram a paralisia dependente da idade nos vermes com TDP-43 e FUS. No dia 12 da idade adulta, cerca de 80 por cento dos vermes TDP-43 não tratados estavam paralisados, em comparação com cerca de 10 por cento dos vermes tratados desde a eclosão. Um ensaio sináptico apontou na mesma direção: os vermes TDP-43 apresentavam hipersensibilidade à aldicarb, um fármaco utilizado para avaliar a transmissão neuromuscular, e o azul de metileno deslocou a resposta novamente para valores mais próximos do normal. A contagem de prolongamentos de neurónios motores em degeneração diminuiu, com o efeito mais evidente a 60 μM. Nos peixes, a natação evocada pelo toque melhorou substancialmente e os axónios motores encurtados voltaram a crescer em direção ao comprimento normal com 30 ou 60 μM, embora a recuperação tenha sido parcial e não completa.

Os dados relativos ao stress oxidativo são compatíveis com uma interpretação antioxidante. Os vermes e peixes mutantes apresentaram indicadores elevados de espécies reativas de oxigénio, que diminuíram com o tratamento, e vermes normais tratados com azul de metileno sobreviveram a um desafio pró-oxidante durante muito mais tempo do que os vermes não tratados. No entanto, há duas limitações importantes. Os níveis totais das proteínas mutantes TDP-43 e FUS não diminuíram, e o estudo não quantificou diretamente os agregados proteicos, pelo que demonstra uma recuperação funcional sem provar a eliminação de agregados. Quem acompanha a forma como as hipóteses redox e mitocondriais são habitualmente formuladas deve considerar o mecanismo como sustentado por evidência, mas não estabelecido.

O momento da administração foi o detalhe mais esclarecedor. Quando os autores esperaram até ao dia 5 da idade adulta para iniciar o tratamento, a taxa de paralisia no dia 12 foi de cerca de 55 por cento, em vez de cerca de 10 por cento com tratamento desde a eclosão. Mesmo composto, mesmo verme, mesma mutação, efeito muito menor. A exposição profilática precoce foi responsável por grande parte do benefício aparente.

O resultado nulo: o que mostrou o estudo em ratinhos SOD1

O estudo de 2011 em ratinhos colocou uma questão mais exigente num sistema mais rigoroso. Os ratinhos congénicos SOD1 G93A progridem desde tremores dos membros posteriores até alterações da marcha e perda do reflexo de endireitamento, terminando num desfecho terminal predefinido. O tratamento começou antes dos sintomas, no dia 45, e continuou diariamente, com observadores a classificarem o estado neurológico numa escala de 0 a 6. Esta é uma experiência que acompanha toda a evolução da doença, o que a aproxima mais daquilo que seria relevante para um doente do que qualquer curva de paralisia num verme.

Os principais resultados foram nulos. O início global ocorreu aos 121 dias nos controlos, em comparação com 124 dias com azul de metileno, uma diferença que não foi significativa. A sobrevivência até à fase terminal foi de 167 dias contra 170 dias, também sem significância. Algumas análises secundárias favoreceram o tratamento: nas fêmeas, observou-se um atraso de cerca de 7 dias no início, e os animais tratados permaneceram durante algum mais tempo nas fases mais ligeiras e menos tempo nas fases graves. Com subgrupos pequenos por sexo e muitas comparações entre fases, estes resultados devem ser lidos como geradores de hipóteses, e não como prova. Não foram efetuadas contagens de neurónios, ensaios de agregação de SOD1 nem medições de marcadores oxidativos ou inflamatórios, pelo que o estudo também não permite determinar se o composto atingiu os seus alvos e falhou ou se simplesmente nunca os afetou com esta dose. Foi testada apenas uma dose.

Os próprios autores assinalaram a limitação mais profunda, aplicável nos dois sentidos. O modelo SOD1 G93A de elevado número de cópias reproduz bem a doença associada à toxicidade de SOD1, mas a doença por SOD1 representa uma pequena fração da ELA familiar e tem uma biologia diferente da maioria dos casos esporádicos. Sugeriram voltar a testar os candidatos em modelos mamíferos baseados em TDP-43. Essa sugestão tornou-se entretanto mais complexa, porque os autores do estudo em vermes e peixes referem que um estudo separado de azul de metileno num modelo de TDP-43 em ratinhos também não conseguiu melhorar os desfechos motores. Assim, um composto pode parecer muito eficaz num sistema TDP-43 e não apresentar efeito noutro sistema TDP-43. O sistema importa tanto como o gene.

Porque é que uma melhoria num verme ou peixe não pode demonstrar benefício em doentes

Considere cada modelo como uma resposta a uma pergunta diferente.

Em primeiro lugar, a biologia difere. TDP-43 e FUS são proteínas de ligação a ácidos nucleicos com interações genéticas partilhadas nestes sistemas simples, enquanto a toxicidade de SOD1 ocorre através de mecanismos proximais parcialmente distintos. Um composto que reduza um tipo de stress proteotóxico não tem necessariamente de reduzir o outro, e o sucesso perante sobre-expressão embrionária não tem necessariamente de prever sucesso perante neurodegeneração adulta lenta com inflamação, envolvimento glial e deterioração sistémica.

Em segundo lugar, a exposição difere. A exposição contínua por banho em concentrações micromolares não equivale a administração oral. Absorção intestinal, metabolismo de primeira passagem, ligação às proteínas plasmáticas, penetração cerebral e depuração interpõem-se entre uma dose ingerida e um neurónio motor da medula espinal. Nenhum dos estudos mediu os níveis do composto no sistema nervoso, pelo que nenhum consegue relacionar a sua concentração com a utilizada no outro.

Em terceiro lugar, o momento da administração difere. Os benefícios nos vermes e peixes dependeram fortemente de o tratamento começar antes da acumulação da patologia. O tratamento nos ratinhos também começou antes dos sintomas, o que constitui um ponto forte, mas o tratamento em humanos começaria quase sempre após o aparecimento dos sintomas, portanto ainda mais tarde. Um sinal profilático num ensaio de dois dias com embriões é um ponto de partida para investigação, não um modelo de utilização clínica.

Em quarto lugar, os desfechos diferem. Paralisia aos 12 dias, sensibilidade à aldicarb, comprimento dos axónios em micrómetros e distância de natação são fenótipos proximais. O início e a sobrevivência num mamífero integram todos os processos compensatórios e complicadores do organismo. É comum que os fármacos alterem indicadores proximais sem alterar a sobrevivência, razão pela qual existem desfechos de tempo até ao evento em mamíferos.

Os leitores que pretendam uma lista de verificação para a próxima manchete podem usar a de como ler estudos pré-clínicos: verifique a espécie, o transgene, a dose e a via de administração, se foram medidos os níveis do composto, quando começou o tratamento em relação à patologia, se o desfecho foi um fenótipo de curto prazo ou a evolução da doença e se o efeito foi replicado num segundo laboratório. O conjunto mais amplo de evidência humana sobre o azul de metileno continua a ser o local onde se deve verificar se algum destes sinais iniciais evoluiu para dados clínicos.

O que isto significa para doentes e famílias

Destes artigos não resulta qualquer protocolo estabelecido de azul de metileno para a ELA. O estudo positivo apoia investigação adicional sobre mecanismos oxidativos e sinápticos na biologia de TDP-43 e FUS. O estudo nulo pesa contra a expectativa de modificação da doença através de administração oral crónica com esta exposição na doença do tipo SOD1. Em conjunto, descrevem uma inconsistência entre modelos, e não uma recomendação de tratamento.

A segurança merece uma abordagem tão sóbria como a eficácia. Estudos de ELA em ratinhos nada dizem sobre uma dose segura em humanos, e o azul de metileno apresenta riscos reais através de hemólise em pessoas com deficiência de G6PD e de toxicidade serotoninérgica quando combinado com fármacos serotoninérgicos. Uma suspeita de deficiência de G6PD, o uso atual de antidepressivos e qualquer alteração planeada da medicação devem ser discutidos com um profissional de saúde, tal como a revisão dos dados gerais de segurança do azul de metileno antes de alguém agir com base em manchetes sobre resultados laboratoriais.

A conclusão cabe numa frase. O azul de metileno produziu uma recuperação acentuada com exposição precoce em fenótipos de TDP-43 e FUS em vermes e peixes em fase larvar, mas praticamente nenhum benefício no início da doença ou na sobrevivência num estudo crónico de SOD1 em ratinhos com administração oral; por isso, a interpretação adequada é a de evidência dependente do modelo que não sustenta a utilização em doentes. :::