Jak błękit metylenowy wnika do komórek: redukcja, ponowne utlenianie i pobieranie

Obserwując, jak komórki śródbłonka na szalce pobierają błękit metylenowy, łatwo dojść do oczywistego, lecz błędnego wniosku. Podłoże traci niebieski kolor, w komórkach pojawiają się niebieskie ziarnistości, więc barwnik musiał przejść przez błonę jako niebieska cząsteczka. Eksperymenty wskazują jednak na coś innego. Niebieska postać przenika przez błonę w bardzo niewielkim stopniu. Przechodzi przez nią postać bezbarwna, a niebieski barwnik widoczny wewnątrz powstaje dopiero w komórce, po wniknięciu.

To odwrócenie perspektywy jest ważne, ponieważ określa, co barwienie może nam powiedzieć, a czego nie. Niebieskie ziarnistości wskazują na obecność utlenionego barwnika, który został ponownie utleniony i zatrzymany w organellach. Nie informują o całkowitej ilości barwnika w komórce ani o puli zredukowanej i nie mierzą efektu biologicznego. Aby zrozumieć dlaczego, prześledźmy trzy etapy: redukcję na powierzchni, dyfuzję postaci zredukowanej oraz ponowne utlenianie i zatrzymywanie wewnątrz.

Dwie postacie zachowują się jak różne cząsteczki

Utleniony błękit metylenowy ma płaski, dodatnio naładowany układ pierścieniowy. Rozpuszcza się w wodzie, silnie pochłania światło w zakresie około 600 do 700 nanometrów i ma niebieski kolor. Kluczowy jest ładunek. Naładowana cząsteczka o powinowactwie do wody nie przechodzi łatwo przez błonę lipidową, dlatego w literaturze ostrożnie określa się ją jako względnie nieprzenikającą przez błonę, a nie całkowicie nieprzenikającą.

Zredukowany błękit metylenowy, zwany leukobłękitem metylenowym, jest bezbarwny, pozbawiony ładunku i rozpuszczalny w tłuszczach. Po usunięciu ładunku błona przestaje stanowić barierę. Zredukowana cząsteczka łatwo przez nią dyfunduje, a po dotarciu do przedziału o bardziej utleniających warunkach może ponownie oddać elektrony i powrócić do niebieskiej, naładowanej postaci, która zostaje zatrzymana. Chemia redoks barwnika jest więc również jego mechanizmem transportu. Zmiana liczby elektronów zmienia zdolność przenikania przez błonę.

Elektrony potrzebne w pierwszym etapie pochodzą z samej komórki. Komórki ssaków prowadzą transport elektronów przez błonę komórkową, przenosząc równoważniki redukujące od wewnątrzkomórkowych donorów na zewnątrz, do akceptorów na powierzchni. Ta aktywność przezbłonowa jest normalną funkcją komórki, występującą w większości typów komórek. Powierzchniowa reduktaza śródbłonka, która redukuje barwniki tiazynowe, zachowuje się podobnie do innych reduktaz pod jednym znamiennym względem: działa nadal w obecności cyjanku i azydku w dawkach, które blokują późniejsze etapy. To rozdzielenie procesów jest kluczem do całej historii.

Najpierw badano podział między fazy — i niemal wyjaśniał on pobieranie

W 1929 Marian Irwin z Instytutu Rockefellera postawiła prostsze pytanie. Być może wnikanie barwnika polega jedynie na jego podziale między wodę a lipidowe warstwy komórki, a warstwa chloroformu może zastąpić te warstwy lipidowe w eksperymencie laboratoryjnym. W swoich spektrofotometrycznych badaniach przenikania wytrząsała wodne roztwory barwników z chloroformem i porównywała to, co przechodziło do fazy organicznej, z tym, co wnikało do żywych komórek glonów.

Dwa ustalenia z tej pracy nadal zasługują na uwagę. Po pierwsze, dostępne handlowo roztwory błękitu metylenowego zawierały trimetylotioninę, obecnie nazywaną Azure B. To zanieczyszczenie przenikało szybciej niż sam błękit metylenowy, zwłaszcza przy zasadowym pH, gdy dominuje rozpuszczalna w lipidach postać wolnej zasady. Część pozornego wnikania błękitu metylenowego była w rzeczywistości selektywnym wnikaniem Azure B. Po drugie, pH decydowało o wyniku, określając stan jonizacji, a uszkodzone komórki przepuszczały znacznie więcej barwnika niż komórki nieuszkodzone. Współczynniki podziału i stan ładunku decydowały o tym, co wchłaniał zarówno sztuczny układ, jak i żywa komórka. Podobieństwo między nimi wspierało koncepcję obecności niewodnych warstw na granicy komórki.

Model trafnie przewidywał rolę lipidów i jonizacji, ale nie pozwalał odróżnić barwnika, który przechodzi do innej fazy bez zmiany postaci chemicznej, od barwnika, który ulega przemianie na powierzchni, przekracza błonę w zmienionej postaci i zostaje ponownie przekształcony wewnątrz. Do rozróżnienia tych możliwości potrzebny był inny eksperyment. Przeprowadzono go siedemdziesiąt lat później na śródbłonku płucnym.

Redukcja na zewnątrz, zatrzymywanie wewnątrz

Merker i współpracownicy badali hodowane komórki śródbłonka tętnicy płucnej bydła i zaproponowali trzyetapową sekwencję: utleniony barwnik jest redukowany na powierzchni komórki do bezbarwnej postaci lipofilowej, postać zredukowana dyfunduje do wnętrza, a ponowne utlenianie wewnątrzkomórkowe odtwarza utlenioną postać nieprzenikającą przez błonę, która się gromadzi. Następnie w swoim badaniu pobierania barwników tiazynowych przez śródbłonek sprawdzili tę sekwencję, próbując przerwać ją w określonych miejscach.

Pierwszym narzędziem był żelazicyjanek, akceptor elektronów, który nie może wnikać do komórki. Gdy enzymy powierzchniowe redukują niebieski barwnik do jego bezbarwnej postaci poza komórką, żelazicyjanek może odebrać te elektrony, odtwarzając niebieski barwnik w podłożu, zanim ten przekroczy błonę. Dopóki żelazicyjanek był obecny w nadmiarze (barwnik w stężeniu 10 mikromolarnym wobec żelazicyjanku w stężeniu od 50 do 500 mikromolarnym), pobieranie barwnika niemal ustawało. Dopiero po zużyciu żelazicyjanku pobieranie wracało do normalnego tempa. Kinetyka potwierdzała ten sam mechanizm w inny sposób. Żelazicyjanek zanikał z w przybliżeniu stałą szybkością, zgodną ze stałym strumieniem redukcji powierzchniowej zasilającym mediator wielokrotnie uczestniczący w cyklu, natomiast barwnik zewnątrzkomórkowy zanikał wykładniczo w miarę wyczerpywania się jego puli. Stały strumień i wyczerpująca się pula oznaczają, że sygnał żelazicyjanku odzwierciedla ciągłą redukcję, a nie opuszczanie roztworu przez cząsteczki barwnika.

Drugie narzędzie całkowicie eliminowało etap przekraczania błony. Zespół przyłączył błękit toluidynowy O, blisko spokrewniony barwnik tiazynowy, do dużego łańcucha poliakrylamidu, zbyt dużego, by mógł wnikać do komórki w którymkolwiek stanie utlenienia. Komórki nadal redukowały związany z nim barwnik. Redukcja nie wymaga więc dostępu do wnętrza komórki. Odpowiedzialny za nią układ jest dostępny na powierzchni lub elektrycznie z nią sprzężony.

Następnie wykazano rozdzielenie procesów, do którego nawiązuje tytuł pracy. Cyjanek i azydek w stężeniu 2 milimolarnym silnie hamowały gromadzenie barwnika, a obserwowane pod mikroskopem ciemnoniebieskie i fioletowe inkluzje, które zwykle otaczają jądro, niemal znikały. Żaden z inhibitorów nie spowalniał jednak redukcji zewnątrzkomórkowej: cykl żelazicyjanku przebiegał bez osłabienia, a nieprzenikający polimer nadal ulegał redukcji. Blokada występowała na dalszym etapie. Cyjanek i azydek hamowały ponowne utlenianie i sekwestrację wewnątrzkomórkową, a nie redukcję powierzchniową. Kontrole żywotności potwierdzały tę interpretację, ponieważ podczas tych zabiegów komórki zachowywały swój cytosolowy enzym markerowy, dehydrogenazę mleczanową. Spadek pobierania nie był więc jedynie skutkiem zatrucia lub rozerwania błony.

Jedno zastrzeżenie z tej pracy pozostaje aktualne. Niebieskie inkluzje znajdowały się wokół jądra, ale nie w jego wnętrzu, co było zgodne z utlenianiem w organellach subkomórkowych. Badanie nie ustaliło jednak, o które organelle chodziło. Podobne wzorce w innych typach komórek przypisywano lizosomom na podstawie skąpych dowodów. Zatrzymywanie barwnika można zatem uznać za potwierdzone, ale jego dokładną lokalizację — za wstępnie określoną. Czytelnicy śledzący dalszą drogę elektronów mogą przejść do omówienia mitochondrialnego transportu elektronów i procesów redoks oraz szerszego obrazu wchłaniania i dystrybucji w zależności od drogi podania.

Barwienie nie jest miarą ekspozycji

Trzecie badanie pokazuje, co się dzieje, gdy ten mechanizm pobierania zestawi się z pomiarem odpowiedzi biologicznej. Scott i współpracownicy stwierdzili, że metylo-beta-cyklodekstryna, cukier o kształcie pierścieniowego torusa, wiąże błękit metylenowy bezpośrednio. Stała asocjacji kompleksu inkluzyjnego wynosi około 310 na mol/l, wobec około 5846 na mol/l dla dimeryzacji barwnika. W fibroblastach L929 to wiązanie blokowało zarówno barwienie komórek, jak i stymulację pobierania glukozy: wstępna inkubacja z cyklodekstryną zapobiegała niebieskiemu zabarwieniu, a jej późniejsze dodanie przyspieszało odbarwianie. W miarę zanikania niebieskiego sygnału optycznego w komórkach pobudzony transport glukozy słabł w ścisłej korelacji z tym procesem.

Autorzy uznali, że ta korelacja przemawia bardziej za bezpośrednim oddziaływaniem barwnika z białkiem w szlaku aktywacji transportera glukozy niż za mechanizmem długotrwałego stresu oksydacyjnego. Wniosek ten jest uzasadniony, ale ma ograniczenia. Eksperyment nie wskazuje konkretnego białka, nie wykazuje wiązania z samym transporterem, a korelacja między odbarwianiem a zanikiem efektu nie pozwala wykluczyć wszystkich mechanizmów zależnych od procesów redoks.

Najważniejsza, trwała lekcja dotyczy pomiaru. Barwienie optyczne wskazuje na widoczny, utleniony barwnik związany z komórką. Całkowicie pomija bezbarwną pulę zredukowaną, dlatego blada komórka nadal może zawierać równoważniki barwnika, a intensywnie zabarwiona komórka wskazuje na zatrzymany utleniony barwnik, nie zaś na całkowitą ekspozycję tkankową lub wielkość efektu. Ta sama ostrożność obowiązuje w większej skali: porównywanie barwienia między typami komórek lub uznawanie ciemnego skrawka tkanki za dowód większej ekspozycji powtarza pierwotny błąd interpretacji obserwacji na szalce. Pobieranie jest cyklem redukcji, dyfuzji i ponownego utleniania, a każdy pojedynczy obraz niebieskiej postaci pokazuje tylko jeden fragment tego cyklu. Bezpośrednio wynikają z tego praktyczne konsekwencje dla barwienia laboratoryjnego i postępowania z barwnikiem oraz dla interpretacji twierdzeń dotyczących dawki i ekspozycji.