Artykuł
Barwienie błękitem metylenowym: metody mikroskopowe i atlas rzeczywistych zdjęć
Barwienie błękitem metylenowym ułatwia rozróżnianie słabo widocznych cech komórek w mikroskopii jasnego pola. Może pomóc uczniom odnaleźć jądro komórki nabłonka policzka lub zbadać zarys i układ drobnoustrojów. Niebieski obiekt jest jednak tylko obserwacją. Określenie organizmu, zmierzenie go i ustalenie, czy wskazuje na chorobę, to odrębne zadania.
Ilustracja okładkowa przedstawia zasadę kontrastu. Poniższy atlas zawiera rzeczywiste fotografie niezależnie udokumentowanych próbek wraz z oryginalnymi informacjami o ich źródłach.
Co uwidacznia błękit metylenowy?
Błękit metylenowy jest barwnikiem zasadowym: jego barwny jon ma ładunek dodatni. Jak wyjaśnia OpenStax w omówieniu barwienia preparatów, barwniki zasadowe oddziałują z ujemnie naładowanym materiałem komórkowym i mogą wyróżniać komórki na jaśniejszym tle. W odpowiednich preparatach błękit metylenowy uwydatnia obszary bogate w kwasy nukleinowe oraz inne struktury wiążące barwnik.
W barwieniu prostym kontrast zapewnia jeden barwnik. Różne organizmy mogą więc wyglądać na niebieskie, mimo że nie są tym samym organizmem. Przydatne pytania mają początkowo charakter opisowy: czy obiekty są okrągłe, czy wydłużone, pojedyncze czy skupione, równomiernie wybarwione czy zróżnicowane wewnętrznie? Zapoznaj się z różnicą między barwieniem prostym a barwieniem metodą Grama, zanim zinterpretujesz kolor jako wynik klasyfikacji.
Kontrast i rozdzielczość to różne właściwości. Kontrast pomaga odróżnić obiekt od otoczenia; rozdzielczość pozwala rozróżnić blisko położone szczegóły. Ciemniejszy obraz nie gwarantuje większej liczby rozróżnialnych struktur. Nie każdą ciemną ziarnistość należy też uznawać za organellum.
Preparaty natywne, barwione preparaty mokre i rozmazy
Niebarwiony, czyli natywny, preparat mokry pozwala obserwować próbkę bez dodatku barwnika, choć samo przeniesienie jej z pierwotnego środowiska już ją zmienia. W barwionym preparacie mokrym dodaje się odczynnik, gdy materiał pozostaje w cieczy pod szkiełkiem nakrywkowym. W utrwalonym rozmazie materiał rozprowadza się na szkiełku podstawowym i przed dalszą obróbką stosuje określoną metodę utrwalania. Przegląd metod przygotowania preparatów w OpenStax rozróżnia preparaty mokre i utrwalanie oraz wyjaśnia, dlaczego utrwalone organizmy nie pozwalają już obserwować prawidłowego ruchu ani metabolizmu.
Te preparaty odpowiadają na różne pytania:
| Preparat | Przydatna obserwacja | Czego nie można ustalić na podstawie samego obrazu |
|---|---|---|
| Natywny preparat mokry | Ruch, zarysy, naturalnie widoczny materiał | Tożsamości organizmu wyłącznie na podstawie ruchu lub kształtu |
| Barwiony preparat mokry | Kontrast między strukturami wiążącymi barwnik a otoczeniem | Czy odczynnik pozostawił prawidłową fizjologię bez zmian |
| Utrwalony, barwiony rozmaz | Morfologia zachowana po określonym przygotowaniu | Jak zachowywał się pierwotny żywy materiał |
| Konkretna metoda barwienia różnicującego | Określona reakcja barwienia z odpowiednimi kontrolami | Tożsamości gatunku ani rozpoznania bez szerszych danych wymaganych przez tę metodę |
Na potrzeby porównania podczas zajęć udokumentuj niebarwiony preparat, zanim obejrzysz osobny barwiony preparat wykonany zgodnie z protokołem dydaktycznym. Zachowaj porównywalne oświetlenie i ustawienia rejestracji obrazu. Jeśli fotografujesz dwie różne komórki, opisuj je jako przykłady, a nie jako zapis jednej komórki przed barwieniem i po nim.
Atlas mikroskopowy: trzy rzeczywiste barwione preparaty
Ten atlas stanowi autorski wybór i interpretację trzech mikrofotografii udostępnionych na otwartych licencjach. Autorzy źródeł określają materiał i użyte barwniki. Nie zweryfikowaliśmy niezależnie ich próbek. Obrazy odtworzono bez kadrowania jako bezstratne konwersje do formatu WebP, bez dodawania elementów ani zmiany kolorów.
Plansza 1: komórki nabłonka ludzkiego policzka
Materiał: komórki nabłonka ludzkiego policzka. Barwnik: błękit metylenowy. Powiększenie: 400×, podane przez autora fotografii. Podziałka skali: niedostępna; źródło nie podaje skalibrowanego rozmiaru piksela. Fotografia autorstwa Fritzmann2002, 2017, ze strony Komórki nabłonka ludzkiego policzka (barwienie błękitem metylenowym), na licencji CC BY-SA 4.0. Ta reprodukcja zachowuje tę licencję.
.jpg){kind=link}
Zacznij od pojedynczej komórki: jej ciemniejsze jądro łatwiej odróżnić od otaczającej niebieskiej cytoplazmy. Następnie przyjrzyj się nakładającym się komórkom poniżej. Nakładanie utrudnia śledzenie granicy i może tworzyć miejscowo ciemniejszy obszar. Wykorzystaj tę planszę do ćwiczenia śledzenia zarysów, a nie do uznawania każdej ciemnej plamy za jądro. Przewodnik obserwacji komórek nabłonka policzka rozwija ćwiczenie dotyczące tego materiału.
Plansza 2: komórki cebuli
Materiał: komórki cebuli, zgodnie z identyfikacją w źródle. Barwnik: błękit metylenowy. Powiększenie: „200x” występuje w oryginalnej nazwie pliku; nie zostało niezależnie zweryfikowane. Podziałka skali: niedostępna; nie podano kalibracji. Fotografia autorstwa Alvy16, 2019, ze strony Komórka cebuli 200x, na licencji CC BY 4.0.
Wydłużone przedziały tworzą uporządkowaną warstwę. Porównaj ich długie wspólne granice z nieregularnymi zarysami na Planszy 1. Zwróć też uwagę na wyraźny ciemny materiał i nierównomierną jasność pola widzenia. Fotografia nie pozwala ustalić, czym jest każdy ciemny osad. Pokazuje, dlaczego użyteczny zapis obserwacji uwzględnia artefakty i niepewność, zamiast przypisywać nazwę wszystkiemu, co przyjmuje barwnik.
Plansza 3: drożdże określone w źródle jako Candida spp.
Materiał: Candida spp., według autorki fotografii. Barwienie: proste barwienie pozytywowe błękitem metylenowym. Powiększenie: niedostępne. Podziałka skali: niedostępna; nie podano skalibrowanego rozmiaru piksela. Fotografia autorstwa Marty, użytkowniczki Wikimedia Martunia.g, 2021, ze strony Barwienie pozytywowe błękitem metylenowym 2, na licencji CC BY 4.0.
Porównaj gęste niebieskie skupiska z mniej zatłoczonymi obrzeżami. Zarysy pojedynczych obiektów łatwiej prześledzić tam, gdzie mniej się nakładają. Nazwa Candida pochodzi z opisu źródłowego, a nie z identyfikacji gatunku przeprowadzonej na podstawie tej fotografii. Ta plansza nie dostarcza też wyniku oceny żywotności. Testy żywotności i oddychania drożdży wymagają własnych warunków, kontroli i interpretacji.
Prawidłowe odczytywanie skali
Te plansze umożliwiają porównanie wizualne, a nie pomiary w mikrometrach czy porównywanie bezwzględnych rozmiarów komórek między planszami. Podane powiększenie nie zastępuje brakującej kalibracji kamery. Zmiana rozmiaru wyświetlanego obrazu zmienia jego pozorne powiększenie.
W przypadku własnych zdjęć wykonaj kalibrację pomiarową, korzystając ze znanego wzorca i odpowiedniego układu optycznego. Przewodnik firmy Nikon po mikrometrii wyjaśnia, jak mikrometr przedmiotowy pozwala przeliczyć umowne jednostki obrazu lub podziałki okularowej na rzeczywiste długości. Zapisz obiektyw, konfigurację kamery i kalibrację, a na podstawie tych danych dodaj podziałkę skali. Nie wyznaczaj jej na podstawie podręcznikowej średniej wielkości komórki.
Czy zawartość butelki odpowiada metodzie?
Butelka oznaczona jako błękit metylenowy nie stanowi kompletnej specyfikacji laboratoryjnej. Sprawdź stężenie i jednostki, rozpuszczalnik, dodatkowe składniki, przeznaczenie, dokumentację partii i instrukcje. Karta charakterystyki odczynnika opisuje zagrożenia; instrukcja metody określa sposób jego użycia do przygotowania zamierzonego preparatu.
Konkretnym przykładem jest roztwór błękitu metylenowego Löfflera firmy Merck. Producent określa go jako odczynnik do mikroskopii i opisuje jego rolę jako barwnika kontrastowego w barwieniu kwasoopornym. Podana palność pokazuje również, dlaczego określenie „niebieska ciecz” nie wystarcza do zaplanowania obchodzenia się z nią lub jej ogrzewania. Te właściwości dotyczą tego składu, a nie automatycznie każdego wodnego roztworu błękitu metylenowego.
Podobnie agar z eozyną i błękitem metylenowym jest pożywką hodowlaną o określonym składzie. Nie jest barwnikiem do preparatów mikroskopowych otrzymywanym przez dodanie samego błękitu metylenowego do próbki. Jeśli cel obrazowania jest inny, porównaj alternatywy dla błękitu metylenowego w mikroskopii.
Pracę z zestawem mikroskopowym dla początkujących zacznij od udokumentowanej metody edukacyjnej, gotowych preparatów o znanej zawartości i wskazanego odczynnika. Jeśli butelka straciła etykietę lub nie można ustalić jej składu, zastąp ją odpowiednim odczynnikiem z dokumentacją. Stosuj ochronę oczu i instrukcje postępowania dostarczone dla konkretnego składu. Materiał ludzki i nieznane próbki środowiskowe wymagają przestrzegania procedur postępowania z próbkami i ich usuwania obowiązujących w pracowni dydaktycznej; barwienie nie zastępuje tych procedur.
Zapisz obserwację przed wnioskiem
„Niebieskie owalne obiekty w skupiskach” to uzasadniony opis obrazu. „Konkretne zakażenie” wymaga dowodów, których ten obraz nie dostarcza. W notatniku oddzielaj pochodzenie próbki, przygotowanie preparatu, reakcję barwienia i metodę identyfikacji. To rozróżnienie sprawia, że prosty obraz z zajęć staje się użyteczny, i zapobiega przypisywaniu atrakcyjnej mikrofotografii twierdzeń, których nie może potwierdzić.