मिथिलिन ब्लुलाई कोशिकीय श्वसनसँग जोड्ने प्रयोगहरू

फाइब्रिन हटाइएको मानव रगतलाई 37 °C मा तीन घण्टासम्म राख्दा त्यसमा रहेको अक्सिजनको करिब दुई प्रतिशत खपत हुन्छ। यसरी राख्नुअघि थोरै मिथिलिन ब्लु थप्दा त्यही रगतले करिब पैंसट्ठी प्रतिशत अक्सिजन खपत गर्छ। कोशिकामा केही फेरिएको थिएन। घोल मात्र फेरिएको थियो।

यो आँकडा जोन्स हप्किन्सका जर्ज ह्यारप र ई. एस. गुजमान ब्यारनको 1928 को शोधपत्रबाट आएको हो, र मिथिलिन ब्लुले कोशिकीय श्वसन सुधार्छ भन्ने बारम्बार दोहोरिने भनाइको मूल यही हो। यो भनाइ गलत होइन, तर सुन्दा लाग्नेभन्दा यसको अर्थ सीमित छ।

तालिकाको आँकडाले वास्तवमा के मापन गर्छ

मापन गरिएको अन्तिम सूचक अक्सिजनको ग्रहण थियो, जुन ग्यास विश्लेषणबाट निर्धारण गरिएको थियो। ह्यारप र ब्यारनले भर्खर निकालिएको रगतलाई 10 °C मा कपासबाट छानेर सेता रक्तकोशिका हटाए, नमुनालाई अक्सिजनले संतृप्त बनाए, त्यसलाई दुई भागमा छुट्याए, एउटा भागमा रञ्जक थपे र इन्क्युबेसनपछि दुवैको विश्लेषण गरे। सेता रक्तकोशिकाको सङ्ख्या विरलै प्रति घन मिलिमिटर करिब एक हजारभन्दा बढी हुन्थ्यो। अक्सिजन खपतलाई नमुनामा सुरुमा रहेको अक्सिजनको कति अंश हरायो भन्ने रूपमा प्रस्तुत गरिएको थियो।

उनीहरूले कार्बन डाइअक्साइड पनि मापन गरे, तर त्यसमा विधिले समस्या निम्त्यायो। अध्ययन गरिएको प्रतिक्रियासँग सम्बन्ध नभएका कारणले फाइब्रिन हटाइएको रगतले इन्क्युबेसनको पहिलो घण्टामा प्रति 100 mL दुई मिलिमोलसम्म कार्बन डाइअक्साइड छोड्थ्यो, त्यसैले सम्पूर्ण रगतबाट निकालिएका श्वसन गुणाङ्क प्रयोगयोग्य थिएनन्। लोकको घोलमा राखिएका धोइएका कोशिकाले मात्र अर्थ लगाउन सकिने आँकडा दिए, र रञ्जक भएको तथा नभएको दुवै अवस्थामा ती 0.73 र 0.80 बीचमा केन्द्रित थिए।

यो विवरण गौण होइन। यी शोधपत्रहरूमा “श्वसन” भन्नाले बन्द पात्रभित्रको ग्यास आदानप्रदान बुझिन्छ। अक्सिजन खपत र उपयोगी ऊर्जा उत्पादनबीचको अन्तरलाई अक्सिजन खपतले ATP बारे के बताउँछ र के बताउँदैन मा छुट्टै केलाइएको छ।

सबैभन्दा कम श्वसन गर्ने कोशिकामा रञ्जकले सबैभन्दा धेरै थप्यो

स्तनधारीका परिपक्व रातो रक्तकोशिकामा मापन गर्न सकिने अक्सिजन खपत लगभग हुँदैन। केन्द्रक भएका चराका रातो रक्तकोशिकामा भने हुन्छ। ह्यारप र ब्यारनले दुवैमा प्रयोग गरे, र यही भिन्नता उनीहरूको तर्कको मुख्य आधार हो।

स्तनधारीका नमुनामा रञ्जकले खपत बीसदेखि पचास गुणासम्म बढायो। हंसको रगतमा, जसका कोशिकाले पहिल्यै श्वसन गर्थे, यसले दरलाई दुई गुणाभन्दा बढी कहिल्यै बढाएन। प्रारम्भिक श्वसन जति बढी थियो, रञ्जकले थप्न सक्ने मात्रा त्यति कम थियो।

एउटै प्रजातिभित्र पनि यही क्रमिक भिन्नता देखिन्छ। अपरिपक्व कोशिका भएको पोलिसाइथेमिया भेरा भएका बिरामीको मानव रगतको नमुनाले रञ्जक नभएको अवस्थामा आफ्नो अक्सिजनको 11.3 प्रतिशत खपत गर्‍यो, जबकि स्वस्थ दाताका धोइएका कोशिकाले 2.8 प्रतिशत मात्र खपत गरे। रञ्जकले त्यसलाई 63.4 प्रतिशतसम्म मात्र पुर्‍यायो—छ गुणा वृद्धि, जबकि सामान्य कोशिकामा झन्डै तीस गुणा वृद्धि भयो। रञ्जकले परिपक्व कोशिकालाई अपरिपक्व कोशिकाको व्यवहारतर्फ धकेल्यो, र लेखकहरूले पनि यसले त्यही गरिरहेको बताएका थिए।

साइनाइडले यसलाई रोक्नुपर्ने थियो

साइनाइडले कोशिकीय अक्सिडेसन रोक्छ भन्ने कुरा ज्ञात थियो। तैपनि ह्यारप र ब्यारनले रञ्जकसँगै साइनाइड पनि थपे।

गाईको रगतका परिणाम यसको प्रतिनिधि उदाहरण हुन्। केही नथप्दा तीन घण्टामा अक्सिजनको मात्रा 22.61 बाट 22.03 आयतन प्रतिशतमा झर्‍यो। मिथिलिन ब्लु थप्दा यो 12.84 मा झर्‍यो। मिथिलिन ब्लुसँगै पाँच हजार भागको एक भाग मोलार पोटासियम साइनाइड थप्दा यो 12.74 मा झर्‍यो। रञ्जकको प्रभावमा वस्तुतः कुनै असर परेन।

चित्र: मानव रातो रक्तकोशिकाको सूक्ष्मश्वसनको निरन्तर अभिलेख। तीरले मिथिलिन ब्लु थपिएको समय देखाउँछ। त्यसअघि रेखा लगभग समतल छ; त्यसपछि निरन्तर उकालो लाग्छ। ह्यारप र ब्यारन, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478 बाट पुनः प्रस्तुत।

उनीहरूको निष्कर्ष थियो कि रञ्जकले अक्सिजन वाहकका रूपमा काम गर्‍यो, “वयस्क स्तनधारीका केन्द्रकविहीन रातो रक्तकोशिकाबाट हराइसकेको पदार्थ उपलब्ध गराएर।” दुई वर्षपछि रकफेलर इन्स्टिच्युटका माइकेलिस र सालोमनले यस असहमतिलाई दीर्घकालीन प्रश्नको रूपमा राखे। कि त रञ्जकको प्रभाव “रञ्जकको एउटा संयोगजन्य गुण” थियो, कि त रञ्जक “जीवहरूमा रहेको कुनै अज्ञात पदार्थको नमुना” थियो। यी दुई सम्भावनाबीचको प्रश्न अझै टुङ्गिएको छैन। परिवर्तन भएको कुरा भनेको अहिले ती कोशिकालाई धेरै स्पष्ट रूपमा वर्णन गर्न सकिन्छ भन्ने हो।

कलेजोको अर्कले पनि उही काम गर्‍यो

माइकेलिस र सालोमनले अङ्गहरूबाट चिसो पानीमा निकालिएका अर्कले पनि उही उत्तेजना उत्पन्न गर्छन् भनेर देखाए। मुसाको कलेजोको प्रभाव सबैभन्दा बलियो थियो, त्यसपछि मिर्गौला, प्लीहा र अण्डकोष थिए। मस्तिष्क, मांसपेशी र रक्तसीरमको प्रभाव थोरै वा शून्य थियो।

त्यसपछि उनीहरूले कार्बन मोनोअक्साइडको उपस्थितिमा अर्कको परीक्षण गरे। अर्क वा रञ्जकले प्रेरित गरेको श्वसन 98 प्रतिशत कार्बन मोनोअक्साइड र 2 प्रतिशत अक्सिजनको मिश्रणमा पनि अपरिवर्तित रह्यो। यही ग्यास मिश्रणले यीस्ट र केन्द्रक भएका कुखुराका रातो रक्तकोशिकाको श्वसन करिब 60 देखि 80 प्रतिशतले रोक्यो, जुन कार्बन मोनोअक्साइडप्रति संवेदनशील श्वसन किण्वकबारे वारबर्गको व्याख्या सँग मेल खान्थ्यो। त्यसैले पहिचान नभएको त्यो तन्तुजन्य पदार्थ वारबर्गको एन्जाइम थिएन।

यस क्रममा धेरै सम्भावित पहिचानहरू अस्वीकृत भए। अपचयित ग्लुटाथायोन र सिस्टिनले आफ्नै अक्सिडेसनका लागि चाहिने अक्सिजन मात्र खपत गराए। हार्डेन र यङको सहएन्जाइमलाई अस्वीकृत गरियो, किनभने त्यो सबैभन्दा धेरै मांसपेशीमा पाइन्छ, तर मांसपेशीले लगभग सबैभन्दा कम प्रभाव देखायो। केही वर्षअघि नाम दिइएको काइलिनको साइटोक्रोममा पनि उही विरोधाभास देखियो। सक्रिय पदार्थ कोशिकाको केन्द्रकबाट आएको हुन सक्छ भन्ने आफ्नै विचारलाई उनीहरूले केवल एउटा सुझाव भने।

प्रभावका लागि केही सर्त थिए

कोशिका अक्षुण्ण हुनुपर्थ्यो। आसुत पानी वा बारम्बार जमाउने प्रक्रियाबाट भएको हेमोलाइसिसले रञ्जक र अर्क दुवैप्रतिको प्रतिक्रिया समाप्त गर्‍यो, र आंशिक हेमोलाइसिसले त्यसलाई सोही अनुपातमा घटायो।

चिनी पनि आवश्यक थियो। ग्लुकोज, फ्रुक्टोज र सुक्रोजले रञ्जकद्वारा प्रेरित श्वसनलाई सहयोग गरे; म्यानिटोलले गरेन। चिनी नभएको अवस्थामा कुनै श्वसन नै भएन, र यस प्रक्रियामा रञ्जकले कोशिकालाई क्षति पुर्‍याएको देखियो, त्यसैले एक वा दुई घण्टापछि थपिएको ग्लुकोजले पनि श्वसन पुनःस्थापित गरेन। लेखकहरूले रञ्जकले कोशिकालाई आवश्यक पर्ने कुनै संरचनात्मक घटकको अक्सिडेसन गरिरहेको हुन सक्छ भन्ने सुझाव दिए।

प्रकाशले रञ्जकको प्रभाव उल्लेख्य रूपमा बढायो, यद्यपि अँध्यारोमा पनि प्रभाव स्पष्ट थियो। अपचयन हुन सक्ने अन्य रञ्जकले फरक व्यवहार देखाए: टोलुइलिन ब्लुको प्रभाव मिथिलिन ब्लु बराबर वा त्योभन्दा बढी थियो, जबकि इन्डिगो डाइसल्फोनेटले लगभग केही गरेन। रञ्जकको अक्सिडेसन–अपचयन विभव र त्यसको प्रभावको परिमाणबीच स्पष्ट सम्बन्ध देखिएन, जसलाई लेखकहरूले झिल्लीको पारगम्यता र विषाक्ततासँग जोडे।

प्रभाव श्वसनसँग होइन, किण्वनसँग सम्बन्धित थियो

ब्यारनको 1930 को अध्ययन कोशिका निलम्बनबाट सामान्य मुसाका अङ्ग र प्रत्यारोपित ट्युमरका तन्तुका पातला खण्डतर्फ अघि बढ्यो।

वायवीय ग्लाइकोलाइसिस नभएका तन्तुमा मिथिलिन ब्लुले केही गरेन वा अक्सिजन खपत अलिकति घटायो: मिर्गौलामा करिब 14 प्रतिशत, अग्न्याशयमा करिब 14 प्रतिशत र कलेजोमा करिब 5 प्रतिशत। अक्सिजनको उपस्थितिमा किण्वन गर्ने तन्तुमा यसले खपत बढायो: प्लीहामा करिब 8 प्रतिशत र मस्तिष्कमा करिब 13 प्रतिशत। ट्युमरमा वृद्धि मानव स्तन कार्सिनोमामा करिब 27 प्रतिशतदेखि राउस कुखुरा सार्कोमामा 80 प्रतिशतभन्दा बढीसम्म थियो, जुन प्रत्येक तन्तुको वायवीय ग्लाइकोलाइसिससँग मोटामोटी समानुपातिक थियो।

चित्र: प्रत्येक बिन्दुले एउटा तन्तुको प्रकार जनाउँछ। तेर्सो अक्ष वायवीय ग्लाइकोलाइसिस हो; ठाडो अक्ष मिथिलिन ब्लु थपेपछि अक्सिजन खपतमा आएको परिवर्तन हो। तथ्याङ्क ब्यारन, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), तालिका 6, PMID 19869777 बाट।

त्यसपछि साइनाइडको प्रयोगले ठीक उल्टो चित्र देखायो। पहिले प्रतिक्रिया नदेखाएका ती तन्तुको श्वसनलाई साइनाइडले रोकेपछि र किण्वन प्रकट भएपछि, रञ्जकले फेरि अक्सिजन खपत बढायो: मिर्गौलामा करिब 59 प्रतिशत, कलेजोमा करिब 19 प्रतिशत, प्लीहामा करिब 286 प्रतिशत र अण्डकोषमा करिब 200 प्रतिशत।

ब्यारनले यो रञ्जक कोशिका वा तन्तुको किण्वन क्षमता जाँच्ने साधन हुन सक्छ भन्ने प्रस्ताव गरे, र एउटा अनुमानसहित लेख टुङ्ग्याए: रञ्जकयुक्त माध्यममा ट्युमरलाई पुस्तौँसम्म कल्चर गर्दा कुनै दिन त्यसको चयापचय स्थायी रूपमा सामान्य तन्तुको जस्तो बन्न सक्छ। त्यो 1930 मा लेखिएको अनुसन्धानको प्रश्न थियो। त्यो उपचारसम्बन्धी दाबी होइन।

प्रयोगहरूले के मापन गरिरहेका हुन सक्दैनथे

1928 र 1930 मा “श्वसन” भन्नाले अक्सिजन खपत बुझिन्थ्यो। एडेनोसिन ट्राइफस्फेटबारे पहिलोपटक 1929 मा रिपोर्ट गरिएको थियो, र अलग गरिएका माइटोकन्ड्रियाले इलेक्ट्रोन स्थानान्तरण गर्दा फस्फेटको एस्टरीकरण गर्छन् भन्ने प्रदर्शन 1949 मा भयो। मिथिलिन ब्लुसम्बन्धी कुनै पनि प्रारम्भिक शोधपत्रले ऊर्जा उत्पादन मापन गरेको हुन सक्दैनथ्यो, र कुनैले त्यसो गरेको दाबी पनि गरेन।

दोस्रो समस्या कोशिका हुन्। स्तनधारीका परिपक्व रातो रक्तकोशिकामा माइटोकन्ड्रिया हुँदैनन्। रेटिकुलोसाइट चरणमा तिनले चयनात्मक अटोफ्याजीद्वारा माइटोकन्ड्रिया र राइबोसोम हटाउँछन्। त्यसैले परिपक्व रातो रक्तकोशिका ग्लाइकोलाइसिसबाट चल्छ र मुख्यतः ATP का लागि नभई NADPH का लागि आफ्नो पेन्टोज फस्फेट मार्गमा निर्भर रहन्छ। 1928 का प्रयोगहरूमा मर्मत गर्नुपर्ने इलेक्ट्रोन परिवहन शृङ्खला नै उपस्थित थिएन। अक्सिजन खपत गर्ने जुनसुकै प्रक्रिया भए पनि, त्यसले अर्कै काम गरिरहेको थियो।

त्यो अर्कै काम के थियो भन्ने कुरा अहिले पर्याप्त स्पष्ट रूपमा वर्णन गरिएको छ। मिथिलिन ब्लुले कोशिकीय अपचायक समतुल्यहरूबाट इलेक्ट्रोन ग्रहण गरेर ल्युकोमिथिलिन ब्लु बन्छ, जसलाई आणविक अक्सिजनले पुनः अक्सिडेसन गर्छ र चक्र पूरा हुन्छ। मानव रातो रक्तकोशिकामा NADPH-निर्भर फ्लाभिन रिडक्टेज र सम्बन्धित डाइसल्फाइड रिडक्टेजहरूले अपचयनको चरण पूरा गर्छन्। चिह्नित ग्लुकोज प्रयोग गरिएको 1976 को अध्ययनले रञ्जकले हेक्सोज मोनोफस्फेट शन्टलाई उत्तेजित गर्छ, कम सान्द्रताको प्रभाव अक्सिहिमोग्लोबिनमा निर्भर थियो र बढी सान्द्रता, 0.1 mM, ले हाइड्रोजन पेरोक्साइड उत्पन्न गर्‍यो भन्ने पत्ता लगायो। अपचयित रञ्जक अक्सिजनसँग भेट्दा पेरोक्साइड उत्पन्न हुन्छ, फस्फेट बन्ध होइन।

माइटोकन्ड्रियामा अवस्था लोकप्रिय सारांशहरूले स्वीकार गरेभन्दा बढी विवादित छ। अनुसन्धानको एउटा धाराले रञ्जकले कम्प्लेक्स I को क्षेत्रबाट इलेक्ट्रोन लिएर साइटोक्रोम c लाई दिन्छ भन्छ। अर्कोले मुसाको मस्तिष्कका माइटोकन्ड्रियामा एन्टिमाइसिनले अवरोध गरेपछि यसले श्वसन पुनःस्थापित गर्न सक्दैन भन्ने पत्ता लगायो, र इलेक्ट्रोन ग्रहण गर्ने स्थानलाई बरु कम्प्लेक्स III को युबिक्विनोल-बन्धन स्थलमा राख्यो। तेस्रोले कम सान्द्रताले विश्राम अवस्थाको अक्सिजन खपत बढायो तर ADP-उत्तेजित श्वसन अपरिवर्तित राख्यो भन्ने पत्ता लगायो। यस विषयको सबैभन्दा प्रत्यक्ष निष्कर्ष यो हो कि मिथिलिन ब्लुले प्रेरित गरेको अक्सिजन खपत अक्सिडेटिभ फस्फोराइलेसनमा निर्भर नै हुँदैन: श्वसन शृङ्खला रोकिएको अवस्थामा र त्यस्तो शृङ्खला नै नभएका नमुनामा पनि यो कायम रह्यो।

यी दुई परिमाणबीचको अन्तरका प्रत्यक्ष मापन पनि छन्। मुसाको कलेजोबाट अलग गरिएका माइटोकन्ड्रियामा रञ्जकको सान्द्रता बढाउँदा श्वसन नियन्त्रण अनुपात घट्यो र माइटोकन्ड्रिया सुन्निए, जसलाई लेखकहरूले अक्सिडेटिभ फस्फोराइलेसनको युग्मन विच्छेद भनेर वर्णन गरे। द्रव प्रवाह गराइएको मुसाको कलेजोमा मिथिलिन ब्लुले अक्सिजन खपत बढायो, जबकि ATP र ADP को अनुपात घट्यो।

चिकित्सकीय अभिलेखले पनि उही सन्देश दिन्छ। मेथिमोग्लोबिनेमियाको उपचार NADPH-निर्भर अपचयन मार्गमार्फत प्रति किलोग्राम करिब एकदेखि दुई मिलिग्राम मिथिलिन ब्लु नसाबाट दिएर गरिन्छ, र बढी मात्राले उपचार गर्न खोजिएको त्यही अवस्था उत्पन्न गर्छ। उही समीक्षाले विषप्रतिरोधी प्रभाव अक्षुण्ण रातो रक्तकोशिकामा सबैभन्दा बढी हुने र हेमोलाइसिस भएको अवस्थामा घट्ने उल्लेख गर्छ। यो 1930 को हेमोलाइसिससम्बन्धी निष्कर्ष त्रिहत्तर वर्षपछि अस्पतालको सन्दर्भमा फेरि देखा परेको हो। उपयोगी र हानिकारक प्रभावहरू मात्राको एउटा सीमाका विपरीत पक्षमा पर्ने यौगिकको मात्रा अक्सिजन खपतको मापनबाट अनुमान गर्नु हुँदैन।

ब्याचलाई छलफलमा किन समावेश गर्नुपर्छ

ह्यारप र ब्यारनले फेरि ध्यान दिएर पढ्न लायक एउटा कुरा देखे। मिथिलिन ब्लु आफैँले स्पेक्ट्रोस्कोपमा मेथिमोग्लोबिनका दुई विशिष्ट पट्टीबीच एउटा पट्टी उत्पन्न गर्छ, “जसले सरसर्ती निरीक्षण गर्दा सजिलै भ्रम उत्पन्न गर्न सक्छ।” रञ्जकले खोजिरहेको पदार्थकै नक्कल गर्न सक्छ।

यही समस्याको रासायनिक रूप पनि छ। न्यून अंशका रूपमा उपस्थित सम्बन्धित फेनोथायाजिनको आफ्नै रेडक्स व्यवहार, आफ्नै पारगम्यता र आफ्नै विषाक्तता हुन्छ। एउटा अभिलेखित उदाहरणले यसको महत्त्व ठोस रूपमा देखाउँछ: मिथिलिन ब्लुको आयोडिनेशनसम्बन्धी अध्ययनमा करिब 7 देखि 8 प्रतिशत Azure B भएका नमुनाले मुख्यतः आयोडिनयुक्त Azure B उत्पन्न गरे, त्यसैले प्रतिक्रियामा मिथिलिन ब्लुभन्दा अशुद्धताको प्रभुत्व रह्यो।

प्रयोगशालामा, रञ्जन गर्ने कार्यस्थलमा वा एक्वेरियममा मिथिलिन ब्लुलाई अभिकर्मकका रूपमा प्रयोग गर्ने जोसुकैले पनि ब्याचको गुणधर्म निर्धारण नगरिएको अवस्थामा अपरिभाषित सामग्रीसँग काम गरिरहेको हुन्छ। सम्बन्धित पदार्थ, पहिचान, तत्त्वगत अशुद्धता, अवशिष्ट विलायक र प्रज्वलनपछिको अवशेष प्रयोगकै अङ्ग हुन्, त्यस वरिपरिका कागजी औपचारिकता होइनन्। Blupreme ले आफ्नो मिथिलिन ब्लु औषधि निर्माताबाट प्राप्त गर्छ र विश्लेषणको पूर्ण प्रमाणपत्र प्रकाशित गर्छ, जसमा भारी धातु मात्र होइन, पूरै USP निर्दिष्टीकरण परीक्षण गरिन्छ; विश्लेषणको प्रमाणपत्र पढ्ने मार्गदर्शिका र USP-ग्रेड पदनामले के स्थापित गर्छ र के गर्दैन ले दाबीअनुसार कागजात कसरी जाँच्ने भन्ने बताउँछन्।

आँकडा सही थियो

1928 र 1930 का प्रयोगहरू सावधानीपूर्वक गरिएका थिए, र तिनको केन्द्रीय अवलोकन आजसम्म टिकेको छ: अपचयन हुन सक्ने रञ्जकले न्यून श्वसन गर्ने कोशिकालाई साइनाइडले रोक्ने चरणबाट नगुजारी, विश्राम अवस्थाको दरभन्दा धेरै गुणा बढी अक्सिजन खपत गराउन सक्छ।

गल्ती पछि देखिन्छ, जब “श्वसन” लाई यसको आधुनिक अर्थमा पढिन्छ। ग्यास आदानप्रदानको मापनले इलेक्ट्रोन अक्सिजनसम्म पुगे भन्ने बताउँछ। त्यसले तीमध्ये कुनै इलेक्ट्रोन ATP बनाउन प्रयोग भयो भन्ने बताउँदैन, र माइटोकन्ड्रिया नभएको कोशिकामा यी दुई कथनबीचको दूरी अधिकतम हुन्छ। मिथिलिन ब्लुले कोशिकामा गर्ने कामको बृहत् नक्सा ले यही भिन्नतालाई फराकिलो सन्दर्भमा राख्छ, र रञ्जकबाट औषधिसम्म यस यौगिकको इतिहास ले कपडामा रङ लगाउने पदार्थ सुरुमा यी प्रयोगसम्म कसरी आइपुग्यो भन्ने स्पष्ट पार्छ।