Identifisering av metylenblått i laboratoriet: infrarøde spektre og supplerende metoder

Tenk deg at tre laboratorier mottar det samme blå pulveret. Det første registrerer et infrarødt spektrum og erklærer at det er metylenblått. Det andre utfører kromatografi og rapporterer 0.4% Azure B. Det tredje undersøker krystallene med røntgendiffraksjon og identifiserer en hydratform. Alle tre har rett, og ingen av dem har besvart de to andre spørsmålene. Forvirringen oppstår når ett resultat tolkes som svar på alle tre.

Denne artikkelen skiller mellom disse spørsmålene. Infrarød identifisering fastslår molekylær identitet ved sammenligning med en referansestandard. Kromatografi fastslår sammensetningen. Diffraksjon fastslår formen i fast tilstand. Et godkjent identitetssamsvar er ikke et renhetssertifikat.

Infrarød identifisering besvarer ett spørsmål godt

Farmakopeens identitetstest for metylenblått er en sammenligning av spektrum og standard, ikke en sjekkliste over topper. I forhåndsvisningen av USP-monografien for metylenblått angir identifikasjon A infrarød spektroskopi med enten ATR-optikk eller en kaliumbromidtablett. Prøvens spektrum må samsvare med spekteret til USP-referansestandarden, og prøve og standard må være klargjort og registrert under likeverdige betingelser. Ingen fast liste over diagnostiske bølgetall avgjør resultatet. Det gjør overlagringen av spektrene.

Dette metodevalget gjenspeiler hvordan FTIR-spektrene til metylenblått oppfører seg. De sterkeste signalene ligger i fingeravtrykksområdet. Tilordninger i litteraturen plasserer gjennomgående hovedbåndet for de konjugerte ringene nær 1590 til 1600 cm-1, der aromatiske karbon-karbon- og karbon-nitrogen-strekkvibrasjoner kobles sammen. Ytterligere bånd nær 1490 og 1390 cm-1 har bidrag fra deformasjoner av ringer, karbon-nitrogen og karbon-hydrogen. Bånd nær 1355 og 1330 cm-1 involverer karbon-nitrogenbindingene i dimetylaminogruppene og deformasjoner av metylgruppene. Signaler nær 1225 til 1250 cm-1 tilhører det heterosykliske rammeverket, mens bånd nær 1170 til 1130 og 1066 cm-1 har bidrag fra karbon-svovel, med aromatisk C-H-bøying nær 880 cm-1. Strekkvibrasjoner forekommer ved høyere bølgetall: aromatisk C-H nær 3040 cm-1 og N-metyl C-H mellom omtrent 2900 og 3000 cm-1. Publiserte tilordninger varierer i detaljene fordi fenotiaziniumskjelettet vibrerer som et koblet system. Betrakt derfor enhver enkelt tilordningstabell som en rapportert tolkning, ikke som den eneste mulige.

To effekter av prøvepreparering fortjener oppmerksomhet fordi de endrer IR-spektrene til metylenblått uten å endre fargestoffet. For det første viser hydratisert materiale et bredt O-H-båndområde rundt 3300 til 3500 cm-1 samt bøyevibrasjoner fra vann nær 1630 til 1640 cm-1, og ulike hydratformer forskyver fingeravtrykksbåndene målbart. For det andre er KBr-tablettmatrisen hygroskopisk: absorbert fuktighet gir bånd i nettopp disse vannområdene og kan forveksles med hydratvann fra prøven. ATR-måling unngår KBr-matrisen, men ATR-intensitetene skalerer med den bølgetallsavhengige inntrengningsdybden. Et ATR-spektrum og et transmisjonsspektrum av det samme pulveret kan derfor ikke overlagres direkte. Den praktiske regelen følger av farmakopekravet: sammenlign prøve og referanse registrert med samme teknikk, og dokumenter hvilken teknikk som ble brukt. For den underliggende kjemien til kationet, saltet og hydratene bak disse spektrene, se referansen om metylenblåtts struktur og egenskaper.

Tabell for valg av analysemetode

Denne tabellen er et verktøy for metodevalg. Les bortover en rad for å finne hvilket spørsmål en metode besvarer, hva et godkjent resultat bekrefter, og hva som fortsatt ikke er dokumentert.

Hvorfor infrarødt samsvar ikke er et renhetssertifikat

Et identitetssamsvar utelukker feil fargestoff. Det kartlegger ikke alt innholdet i prøven. Tre begrensninger er særlig viktige.

For det første ser nært beslektede stoffer like ut i det infrarøde området. Azure B skiller seg fra metylenblått med bare én metylgruppe, så spekteret ligner sterkt på spekteret til metylenblått. En blanding med noen få prosent Azure B samsvarer fortsatt godt ved overlagring med en metylenblåttreferanse. Påvisning av denne urenheten krever kromatografi, som omtales i veiledningen om urenheter i metylenblått og testmetoder.

For det andre er infrarød spektroskopi en metode som måler prøven som helhet, med begrenset følsomhet for mindre bestanddeler. Små mengder beslektede fargestoffer, restløsemidler eller uorganiske rester skjules under hovedbåndene. Fravær av ekstra topper er svakt belegg for fravær av urenheter.

For det tredje styrer referansestandarden hele sammenligningen. En standard som er nedbrutt, har fått spekteret forskjøvet ved hydratisering eller er håndtert feil, endrer sammenligningsgrunnlaget. Det samme gjør en kombinasjon av ulike teknikker, for eksempel når et ATR-spektrum av prøven vurderes mot en KBr-referanse. Registrer standardens batch, teknikken og prøveprepareringen sammen med hver konklusjon.

Blandinger krever en siste påminnelse om varsomhet. Et spektrum som stort sett samsvarer, men har skuldre eller avvikende intensiteter, er ikke et godkjent resultat med fotnoter. Det er et signal om å separere prøven før den identifiseres.

Supplerende metoder i praksis

HPLC av metylenblått gir svaret om sammensetning som infrarød spektroskopi ikke kan gi. Den gjeldende farmakopémetoden bruker en kolonne av fenyltypen med en vann-acetonitril-gradient som inneholder trifluoreddiksyre, og detekterer ved 246 nm, ikke i det synlige området. Identiteten fastslås ved samsvar i retensjonstid med referansestandarden; den samme sammenligningen brukes til innholdsbestemmelsen. Testen for organiske urenheter tilordner Azure B ved hjelp av eget referansemateriale, med en relativ retensjon nær 0.8 mot metylenblått ved 1.0, og krever høy oppløsning mellom de to toppene. Merk valget av bølgelengde: demetyleringsserien absorberer gradvis lenger mot rødt, fra tionin nær 600 nm via Azure C, Azure A og Azure B til metylenblått nær 670 nm. En detektor innstilt nær 660 nm gir derfor ulik respons gjennom serien og undervurderer enkelte homologer. Full profilering av hele serien bør ved behov utføres med en C18 LC-MS/MS-metode med kvalifiserte standarder for hver analytt.

Pulverdiffraksjon besvarer spørsmålet om faststofform som de to metodene ovenfor enten ødelegger informasjonsgrunnlaget for eller overser: oppløsning av pulveret til kromatografi fjerner krystallinformasjonen, og molekylære vibrasjoner gir informasjon om bindinger fremfor den langtrekkende pakkingen. Diffraksjonsmønstre skiller mellom hydratfaser og viser krystallinitet, og metylenblått trenger slik granskning mer enn de fleste materialer. Faststoffstudier av Rager og kolleger identifiserte fem forskjellige hydratstrukturer, inkludert et pentahydrat, to dihydrater, et monohydrat og et mellomliggende hydrat, og fant ikke noe ekte trihydrat blant de karakteriserte formene. Håndteringen i laboratoriet er viktig her: fuktighet og temperatur påvirker hydratenes stabilitet, og kraftig maling kan endre fasen eller redusere krystalliniteten. Kontroller og dokumenter derfor relativ luftfuktighet og temperatur, og begrens malingen til et minimum. Merking av hydrater og hvordan hydratformen påvirker innveid masse, omtales nærmere i hydratformer og merking av metylenblått.

UV-Vis-absorpsjon har en supplerende rolle. De kjente maksimaene bekrefter forventet oppførsel i løsning og muliggjør konsentrasjonsbestemmelse. En blå løsning som absorberer ved forventet bølgelengde, er imidlertid forenlig med metylenblått uten å bevise identiteten, siden beslektede fargestoffer absorberer i nærheten.

Hva du bør spørre om før kjøp

Omsett disse forskjellene til spørsmål ved innkjøp. Spør hvilken batch som ble testet, hvilken teknikk som fastslo identiteten, om HPLC-testen for urenheter brukte Azure B-referansematerialet, og om hydratformen ble karakterisert eller antatt. Spør fremfor alt om sertifikatet dekker hele spesifikasjonen eller bare utvalgte tester. Mange selgere som hevder samsvar med farmakopeen, tester bare tungmetaller. Da står spørsmål om identitet, innhold, organiske urenheter, løsemidler og mikrobiologisk kvalitet ubesvart.

Blupreme tester hele USP-spesifikasjonen, som omfatter identitet, renhet, organiske urenheter, restløsemidler, elementære urenheter, gløderest, mikrobiologiske grenser og bakterielle endotoksiner, i samarbeid med en farmasøytisk produsent av metylenblått. Det offentlige analysesertifikatet for hver batch publiseres på Blupremes kvalitetstesting, slik at grunnlaget for innholdsbestemmelsen og urenhetsresultatene kan leses direkte i stedet for å utledes. Resultater nær 100% må fortsatt ha beregningsgrunnlaget oppgitt, slik veiledningen om innholdsbestemmelse over 100 prosent forklarer. Identitetssamsvar innleder undersøkelsen. Den fullstendige dokumentasjonen avslutter den.