L-esperimenti li rabtu l-blu tal-metilen mar-respirazzjoni ċellulari

Demm uman defibrinat, imsaħħan għal 37 °C għal tliet sigħat, jikkonsma madwar tnejn fil-mija tal-ossiġnu li fih. Żid kwantità żgħira ta’ blu tal-metilen qabel l-inkubazzjoni, u l-istess demm jikkonsma madwar ħamsa u sittin fil-mija. Ma nbidel xejn fiċ-ċelloli. Inbidlet biss is-soluzzjoni.

Dak in-numru ġej minn artiklu tal-1928 minn George Harrop u E. S. Guzman Barron f’Johns Hopkins, u minnu oriġinat l-istqarrija ripetuta ta’ spiss li l-blu tal-metilen itejjeb ir-respirazzjoni ċellulari. L-istqarrija mhijiex falza, iżda t-tifsira tagħha hija aktar limitata milli tidher.

X’ikejjel fil-fatt in-numru fit-tabella

Il-kejl finali kien l-assorbiment tal-ossiġnu, iddeterminat permezz tal-analiżi tal-gassijiet. Harrop u Barron iffiltraw demm li kien għadu kemm ittieħed minn ġol-qoton f’10 °C biex ineħħu ċ-ċelloli bojod, saturaw il-kampjun bl-ossiġnu, qasmuh, żiedu ż-żebgħa ma’ parti minnu, u analizzaw iż-żewġ partijiet wara l-inkubazzjoni. L-għadd tal-lewkoċiti rari qabeż madwar elf għal kull millimetru kubu. Il-konsum tal-ossiġnu ġie rrappurtat bħala l-proporzjon tal-kontenut inizjali tal-ossiġnu fil-kampjun li kien għeb.

Kejlu wkoll id-diossidu tal-karbonju, u hemmhekk il-metodu ħoloq diffikultajiet. Id-demm defibrinat irrilaxxa sa żewġ millimoli ta’ diossidu tal-karbonju għal kull 100 mL fl-ewwel siegħa tal-inkubazzjoni għal raġunijiet mhux relatati mar-reazzjoni li kienet qed tiġi studjata, u għalhekk il-kwozjenti respiratorji mid-demm sħiħ ma setgħux jintużaw. Ċelloli maħsula fis-soluzzjoni ta’ Locke biss taw valuri li setgħu jiġu interpretati, u dawn kienu bejn 0.73 u 0.80 kemm biż-żebgħa kif ukoll mingħajrha.

Dan id-dettall mhuwiex trivjali. F’dawn l-artikli, “respirazzjoni” tfisser skambju ta’ gassijiet f’reċipjent magħluq. Id-distakk bejn il-konsum tal-ossiġnu u l-produzzjoni ta’ enerġija utli jiġi eżaminat separatament f’dak li l-konsum tal-ossiġnu jgħidlek u ma jgħidlekx dwar l-ATP.

Iż-żebgħa żiedet l-aktar fejn iċ-ċelloli rrespiraw l-inqas

L-eritroċiti maturi tal-mammiferi għandhom kważi l-ebda konsum tal-ossiġnu li jista’ jitkejjel. L-eritroċiti tal-għasafar li għandhom nukleu għandhom konsum li jista’ jitkejjel. Harrop u Barron ittestjaw it-tnejn, u dan il-kuntrast huwa l-bażi tal-argument tagħhom.

Fil-kampjuni tal-mammiferi, iż-żebgħa pproduċiet żidiet ta’ bejn għoxrin u ħamsin darba. Fid-demm tal-wiżż, li ċ-ċelloli tiegħu diġà kienu jirrespiraw, qatt ma żiedet ir-rata għal aktar mid-doppju. Aktar ma kienet għolja r-respirazzjoni inizjali, inqas setgħet iżżid iż-żebgħa.

L-istess gradjent jidher fi ħdan speċi waħda. Kampjun uman minn pazjent bil-poliċitemija vera, li kien fih ċelloli immaturi, ikkonsma 11.3 fil-mija tal-ossiġnu tiegħu mingħajr żebgħa, meta mqabbel ma’ 2.8 fil-mija għal ċelloli maħsula minn donatur b’saħħtu. Iż-żebgħa tellgħetu biss għal 63.4 fil-mija, aċċelerazzjoni ta’ sitt darbiet fejn iċ-ċelloli normali aċċeleraw kważi tletin darba. Iż-żebgħa wasslet liċ-ċelloli maturi biex iġibu ruħhom aktar bħal dawk immaturi, u hekk qalu l-awturi li kienet qed tagħmel.

Iċ-ċjanur suppost waqqafha

Kien magħruf li ċ-ċjanur iwaqqaf l-ossidazzjoni ċellulari. Harrop u Barron żieduh xorta waħda, flimkien maż-żebgħa.

Ir-riżultati tad-demm bovin huma rappreżentattivi. Il-kontenut tal-ossiġnu niżel minn 22.61 għal 22.03 fil-mija bil-volum fuq tliet sigħat mingħajr ebda żieda. Bil-blu tal-metilen niżel għal 12.84. Bil-blu tal-metilen u ċjanur tal-potassju f’konċentrazzjoni molari ta’ wieħed fuq ħamest elef, niżel għal 12.74. L-effett taż-żebgħa essenzjalment ma ntmessx.

Figura: reġistrazzjoni kontinwa tal-mikrorespirazzjoni tal-eritroċiti umani. Il-vleġġa tindika ż-żieda tal-blu tal-metilen. Qabelha, il-linja hija kważi ċatta; warajha titla’ b’mod kostanti. Riprodotta minn Harrop u Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Il-konklużjoni tagħhom kienet li ż-żebgħa aġixxiet bħala trasportatur tal-ossiġnu, “billi tipprovdi sustanza li għebet mill-eritroċiti mingħajr nukleu tal-mammiferi adulti.” Sentejn wara, Michaelis u Salomon fl-Istitut Rockefeller esprimew in-nuqqas ta’ qbil fil-forma li baqgħet magħrufa. Jew l-effett taż-żebgħa kien “proprjetà aċċidentali taż-żebgħa,” jew iż-żebgħa kienet “mudell għal xi sustanza mhux magħrufa fl-organiżmi.” Dawn iż-żewġ possibbiltajiet għadhom ma ġewx riżolti. Li nbidel huwa li ċ-ċelloli issa jistgħu jiġu deskritti b’ħafna aktar preċiżjoni.

Estratt tal-fwied għamel l-istess ħaġa

Michaelis u Salomon urew li estratti ta’ organi miksuba bl-ilma kiesaħ jipproduċu l-istess stimulazzjoni. Il-fwied tal-far kellu l-aktar effett qawwi, segwit mill-kliewi, il-milsa u t-testikolu. Il-moħħ, il-muskolu u s-serum tad-demm kellhom ftit jew ebda effett.

Imbagħad ittestjaw l-estratt kontra l-monossidu tal-karbonju. Ir-respirazzjoni indotta mill-estratt jew miż-żebgħa baqgħet l-istess f’taħlita ta’ 98 fil-mija monossidu tal-karbonju u 2 fil-mija ossiġnu. L-istess taħlita ta’ gassijiet inibiet ir-respirazzjoni tal-ħmira u dik tal-eritroċiti bit-nukleu tat-tjur b’madwar 60 sa 80 fil-mija, skont id-deskrizzjoni ta’ Warburg ta’ ferment respiratorju sensittiv għall-monossidu tal-karbonju. Għalhekk, is-sustanza mhux identifikata tat-tessut ma kinitx l-enzima ta’ Warburg.

Matul l-investigazzjoni ġew esklużi diversi identitajiet possibbli. Il-glutatjon ridott u ċ-ċisteina pproduċew biss il-konsum tal-ossiġnu meħtieġ għall-ossidazzjoni tagħhom stess. Il-koenzima ta’ Harden u Young ġiet eskluża għax il-muskolu fih l-akbar ammont tagħha u wera kważi l-inqas effett. Iċ-ċitokromu ta’ Keilin, li kien ingħata ismu ftit snin qabel, iltaqa’ mal-istess kontradizzjoni. Is-suġġeriment tagħhom stess, li s-sustanza attiva kienet ġejja min-nukleu taċ-ċellola, sejħulu sempliċi suġġeriment.

L-effett kien jiddependi minn ċerti kundizzjonijiet

Iċ-ċelloli kellhom ikunu intatti. L-emoliżi permezz ta’ ilma distillat jew iffriżar ripetut eliminat ir-rispons kemm għaż-żebgħa kif ukoll għall-estratt, u l-emoliżi parzjali naqqsitu proporzjonalment.

Iz-zokkor kien meħtieġ ukoll. Il-glukożju, il-fruttożju u s-sukrożju sostnew ir-respirazzjoni indotta miż-żebgħa; il-mannitol ma sostniehiex. Mingħajr zokkor ma kien hemm ebda respirazzjoni, u ż-żebgħa dehret li tagħmel ħsara liċ-ċelloli matul il-proċess, għalhekk il-glukożju miżjud siegħa jew sagħtejn wara ma reġax ġabha lura. L-awturi ssuġġerew li ż-żebgħa kienet qed tossida komponent strutturali li ċ-ċellola kellha bżonn.

L-illuminazzjoni żiedet l-effett taż-żebgħa b’mod konsiderevoli, għalkemm l-effett kien ċar fid-dlam. Żebgħat oħra li jistgħu jiġu ridotti ġabu ruħhom b’mod differenti: il-blu tat-toluilen laħaq jew qabeż l-effett tal-blu tal-metilen, filwaqt li d-disulfonat tal-indigo kważi m’għamel xejn. Ma ħarġet ebda relazzjoni ċara bejn il-potenzjal ta’ ossidazzjoni-riduzzjoni ta’ żebgħa u d-daqs tal-effett tagħha, ħaġa li l-awturi attribwew għall-permeabbiltà tal-membrana u t-tossiċità.

L-effett kien isegwi l-fermentazzjoni, mhux ir-respirazzjoni

L-istudju ta’ Barron tal-1930 mexa minn sospensjonijiet ta’ ċelloli għal flieli ta’ tessuti ta’ organi normali tal-far u tumuri trapjantati.

F’tessuti mingħajr glikoliżi aerobika, il-blu tal-metilen ma għamel xejn jew naqqas ftit il-konsum tal-ossiġnu: fil-kliewi b’madwar 14 fil-mija, fil-frixa b’madwar 14 fil-mija, fil-fwied b’madwar 5 fil-mija. F’tessuti li jiffermentaw fil-preżenza tal-ossiġnu, żied il-konsum: fil-milsa b’madwar 8 fil-mija, fil-moħħ b’madwar 13 fil-mija. Iż-żidiet fit-tumuri varjaw minn madwar 27 fil-mija f’karċinoma tas-sider umana għal aktar minn 80 fil-mija f’sarkoma ta’ Rous fit-tiġieġ, bejn wieħed u ieħor proporzjonalment għall-glikoliżi aerobika ta’ kull tessut.

Figura: kull punt jirrappreżenta tip wieħed ta’ tessut. L-assi orizzontali huwa l-glikoliżi aerobika; l-assi vertikali huwa l-bidla fil-konsum tal-ossiġnu wara l-blu tal-metilen. Data minn Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabella 6, PMID 19869777.

L-esperiment biċ-ċjanur imbagħad ipproduċa r-riżultat oppost. Meta r-respirazzjoni f’dawk it-tessuti li qabel ma kinux wieġbu ġiet imblukkata biċ-ċjanur u l-fermentazzjoni ħarġet fid-deher, iż-żebgħa reġgħet żiedet il-konsum tal-ossiġnu: fil-kliewi b’madwar 59 fil-mija, fil-fwied b’madwar 19 fil-mija, fil-milsa b’madwar 286 fil-mija, fit-testikolu b’madwar 200 fil-mija.

Barron ippropona li ż-żebgħa setgħet tintuża bħala test għall-kapaċità fermentattiva ta’ ċellola jew tessut, u għalaq bi spekulazzjoni: ġenerazzjonijiet ta’ kulturi ta’ tumur f’medju li fih iż-żebgħa jistgħu xi darba jagħmlu l-metaboliżmu tat-tumur permanentement bħal dak ta’ tessut normali. Dik kienet mistoqsija ta’ riċerka miktuba fl-1930. Mhijiex pretensjoni ta’ trattament.

X’ma setgħux kienu qed ikejlu l-esperimenti

Fl-1928 u fl-1930, “respirazzjoni” kienet tfisser konsum tal-ossiġnu. It-trifosfat tal-adenosina ġie rrappurtat għall-ewwel darba fl-1929, u d-dimostrazzjoni li l-mitokondriji iżolati jesterifikaw il-fosfat waqt li jittrasferixxu l-elettroni saret fl-1949. Ebda wieħed mill-ewwel artikli dwar il-blu tal-metilen ma seta’ jkejjel il-produzzjoni tal-enerġija, u ebda wieħed minnhom ma sostna li għamel dan.

Iċ-ċelloli huma t-tieni problema. L-eritroċiti maturi tal-mammiferi ma fihomx mitokondriji. Matul l-istadju tar-retikuloċiti jeliminaw il-mitokondriji u r-ribosomi permezz ta’ awtofaġija selettiva, u għalhekk ċellola ħamra matura taħdem bil-glikoliżi u tiddependi fuq il-mogħdija tagħha tal-fosfat tal-pentożju prinċipalment għan-NADPH aktar milli għall-ATP. Fl-esperimenti tal-1928 ma kien hemm ebda katina tat-trasport tal-elettroni x’tissewwa. Dak li kien qed jikkonsma l-ossiġnu kien qed jagħmel xi ħaġa oħra.

X’kienet dik il-ħaġa l-oħra issa huwa deskritt pjuttost tajjeb. Il-blu tal-metilen jaċċetta elettroni minn ekwivalenti riduċenti ċellulari u jsir lewkoblu tal-metilen, li jerġa’ jiġi ossidat mill-ossiġnu molekulari, u b’hekk jagħlaq iċ-ċiklu. Fiċ-ċelloli ħomor umani, ir-riduttażi tal-flavina dipendenti fuq in-NADPH u riduttażi tad-disulfidi relatati jwettqu l-pass tar-riduzzjoni. Studju tal-1976 li uża glukożju mmarkat sab li ż-żebgħa tistimula l-mogħdija alternattiva tal-monofosfat tal-eżożju, li l-effett f’konċentrazzjoni baxxa kien jiddependi mill-ossiemoglobina, u li konċentrazzjoni ogħla, 0.1 mM, iġġenerat perossidu tal-idroġenu. Żebgħa ridotta li tiltaqa’ mal-ossiġnu tipproduċi perossidu, mhux rabtiet tal-fosfat.

Fil-mitokondriji, l-istampa hija aktar ikkontestata milli jammettu s-sommarji popolari. Linja waħda ta’ riċerka ssostni li ż-żebgħa tieħu elettroni mir-reġjun tal-kumpless I u tgħaddihom liċ-ċitokromu c. Oħra sabet li fil-mitokondriji tal-moħħ tal-ġrieden ma tistax tirrestawra r-respirazzjoni wara imblokk bl-antimiċina, u minflok poġġiet l-aċċettur tal-elettroni fis-sit tal-irbit tal-ubikinol tal-kumpless III. It-tielet sabet li konċentrazzjonijiet baxxi żiedu l-konsum tal-ossiġnu fil-mistrieħ filwaqt li ħallew ir-respirazzjoni stimulata mill-ADP l-istess. L-aktar formulazzjoni diretta tal-punt hija li l-konsum tal-ossiġnu indott mill-blu tal-metilen ma jiddependi xejn mill-fosforilazzjoni ossidattiva: baqa’ għaddej meta l-katina respiratorja kienet inibita, u fi preparazzjonijiet mingħajrha.

Jeżisti wkoll kejl dirett tad-distakk bejn iż-żewġ kwantitajiet. F’mitokondriji iżolati tal-fwied tal-far, konċentrazzjonijiet dejjem ogħla taż-żebgħa naqqsu l-proporzjonijiet tal-kontroll respiratorju u kkawżaw nefħa, li l-awturi ddeskrivew bħala diżakkoppjament tal-fosforilazzjoni ossidattiva. Fil-fwied tal-far perfuż, il-blu tal-metilen żied il-konsum tal-ossiġnu filwaqt li l-proporzjon ATP għal ADP naqas.

L-evidenza klinika twassal l-istess messaġġ. Il-metemoglobinemija tiġi ttrattata b’madwar milligramma sa żewġ milligrammi ta’ blu tal-metilen għal kull kilogramma ġol-vina, permezz ta’ mogħdija ta’ riduzzjoni dipendenti fuq in-NADPH, u dożi akbar jikkawżaw il-kundizzjoni li tkun qed tiġi ttrattata. L-istess reviżjoni tinnota li l-effett bħala antidotu huwa l-akbar f’eritroċiti intatti u jonqos meta jkun hemm emoliżi, jiġifieri s-sejba dwar l-emoliżi tal-1930 li terġa’ tidher tlieta u sebgħin sena wara f’kuntest ta’ sptar. Kompost li l-effetti utli u ta’ ħsara tiegħu jinsabu fuq naħat opposti ta’ limitu tad-doża mhuwiex kompost li d-doża tiegħu għandha tiġi dedotta minn kejl tal-konsum tal-ossiġnu.

Għaliex il-lott għandu jkun parti mid-diskussjoni

Harrop u Barron innutaw xi ħaġa li jistħoqqilha qari ieħor. Il-blu tal-metilen innifsu jipproduċi faxxa fl-ispettroskopju bejn iż-żewġ faxex karatteristiċi tal-metemoglobina, “li tista’ faċilment tikkawża konfużjoni waqt spezzjoni superfiċjali.” Iż-żebgħa tista’ timita s-sustanza li tkun qed tiġi mfittxija.

L-istess problema għandha forma kimika. Fenotijażina relatata preżenti bħala kostitwent minuri għandha l-imġiba redox tagħha stess, il-permeabbiltà tagħha stess u t-tossiċità tagħha stess. Każ dokumentat wieħed jagħmel il-konsegwenzi konkreti: fi studju dwar il-jodinazzjoni tal-blu tal-metilen, kampjuni li kien fihom madwar 7 sa 8 fil-mija Azure B ipproduċew prinċipalment Azure B jodinat, u għalhekk l-impurità aktar milli l-blu tal-metilen iddominat ir-reazzjoni.

Kull min juża l-blu tal-metilen bħala reaġent, f’laboratorju, fuq bank tax-xogħol għat-tbajja’ jew f’akkwarju, ikun qed jaħdem b’ingredjent mhux speċifikat sakemm il-lott ma jkunx ġie kkaratterizzat. Sustanzi relatati, identità, impuritajiet elementali, solventi residwi u residwu wara t-tqabbid huma parti mill-esperiment aktar milli burokrazija madwaru. Blupreme jikseb il-blu tal-metilen tiegħu mingħand manifattur farmaċewtiku u jippubblika ċertifikat sħiħ ta’ analiżi, billi jittestja l-ispeċifikazzjoni kollha tal-USP aktar milli l-metalli tqal biss; il-gwida għall-qari ta’ ċertifikat ta’ analiżi u dak li d-denominazzjoni ta’ grad USP tistabbilixxi u ma tistabbilixxix jispjegaw kif tqabbel id-dokument ma’ dak li qed jiġi sostnut.

In-numru kien korrett

L-esperimenti tal-1928 u tal-1930 twettqu bir-reqqa, u l-osservazzjoni ċentrali tagħhom baqgħet valida: żebgħa li tista’ tiġi ridotta tista’ ġġiegħel ċellola li bilkemm tirrespira tikkonsma l-ossiġnu b’rata ħafna drabi ogħla minn dik tagħha fil-mistrieħ, mingħajr ma tgħaddi mill-pass li ċ-ċjanur jimblokka.

L-iżball jidher aktar tard, meta “respirazzjoni” tinqara bit-tifsira moderna tagħha. Kejl tal-iskambju tal-gassijiet jgħidlek li l-elettroni waslu għand l-ossiġnu. Ma jgħidlekx li xi wieħed minnhom intuża biex isir l-ATP, u f’ċellola mingħajr mitokondriji d-distanza bejn dawn iż-żewġ stqarrijiet hija wiesgħa kemm tista’ tkun. Il-mappa usa’ ta’ dak li jagħmel il-blu tal-metilen fiċ-ċelloli tqiegħed l-istess distinzjoni f’qafas usa’, u l-istorja tal-kompost minn żebgħa għal mediċina tispjega kif kolorant tat-tessuti wasal għal dawn l-esperimenti fl-ewwel lok.