Cara metilena biru memasuki sel: penurunan, pengoksidaan semula, pengambilan

Apabila anda melihat sel endotelium dalam piring menyerap metilena biru, tafsiran yang paling jelas juga merupakan tafsiran yang salah. Medium kehilangan warna birunya, manakala sel memperoleh granul biru, jadi pewarna itu pasti telah merentasi membran sebagai molekul biru. Namun, eksperimen menunjukkan sebaliknya. Bentuk biru hampir tidak merentasi membran. Yang merentasinya ialah bentuk tidak berwarna, dan warna biru yang anda lihat di dalam sel terbentuk di situ, selepas molekul itu tiba.

Pembalikan ini penting kerana ia menentukan perkara yang boleh dan tidak boleh diketahui daripada pewarnaan. Granul biru menunjukkan pewarna teroksida yang telah mengalami pengoksidaan semula dan terperangkap dalam organel. Granul ini tidak menunjukkan jumlah keseluruhan pewarna dalam sel, tidak menunjukkan kumpulan pewarna terturun, dan tidak mengukur kesan biologi. Untuk memahami sebabnya, ikuti tiga langkah ini: penurunan di permukaan, resapan bentuk terturun, serta pengoksidaan semula dan pemerangkapan di dalam sel.

Kedua-dua bentuk berkelakuan seperti molekul yang berbeza

Metilena biru teroksida ialah sistem gelang yang rata dan bercas positif. Ia larut dalam air, menyerap cahaya dengan kuat pada sekitar 600 hingga 700 nanometers, dan kelihatan biru. Cas itulah faktor utamanya. Molekul bercas yang mempunyai afiniti terhadap air tidak mudah merentasi membran lipid, maka ungkapan yang digunakan secara berhati-hati dalam literatur ialah secara relatif tidak telap membran, bukannya tidak telap sama sekali.

Metilena biru terturun, yang dipanggil leukometilena biru, tidak berwarna, tidak bercas dan larut dalam lemak. Apabila cas disingkirkan, membran tidak lagi menjadi penghalang. Molekul terturun itu mudah meresap merentasinya, dan apabila berada dalam kompartmen yang lebih mengoksidakan, ia boleh kehilangan elektron sekali lagi lalu kembali kepada bentuk biru yang bercas dan terperangkap. Oleh itu, kimia redoks pewarna ini juga merupakan mekanisme pengangkutannya. Apabila bilangan elektron berubah, ketelapannya turut berubah.

Elektron untuk langkah pertama berasal daripada sel itu sendiri. Sel mamalia menjalankan pengangkutan elektron merentasi membran plasma, memindahkan setara penurunan daripada penderma intrasel ke luar, kepada penerima di permukaan. Aktiviti merentasi membran plasma ini ialah fungsi normal sel yang terdapat dalam kebanyakan jenis sel, dan reduktase permukaan endotelium yang mengendalikan pewarna tiazina berkelakuan seperti reduktase lain dalam satu aspek yang penting: ia terus berfungsi dengan kehadiran sianida dan azida pada dos yang menghentikan langkah-langkah berikutnya. Pemisahan fungsi inilah kunci kepada keseluruhan penjelasan ini.

Pempartisian dikaji terlebih dahulu, dan hampir menjelaskan pengambilan

Pada tahun 1929, Marian Irwin di Institut Rockefeller mengemukakan soalan yang lebih mudah. Mungkin kemasukan pewarna hanyalah pempartisian antara air dengan lapisan berlemak sel, dan lapisan kloroform boleh mewakili lapisan berlemak itu dalam eksperimen makmal. Dalam kajian penembusan secara spektrofotometri beliau(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19872469/), larutan pewarna berair digoncang bersama kloroform, kemudian bahan yang berpindah ke fasa organik dibandingkan dengan bahan yang memasuki sel alga hidup.

Dua penemuan daripada kajian itu masih wajar diberi perhatian. Pertama, larutan metilena biru komersial mengandungi trimetil tionina, yang kini dipanggil azure B, dan bendasing itu menembusi sel lebih cepat daripada metilena biru sendiri, khususnya pada pH beralkali apabila bentuk bes bebas yang larut dalam lipid mendominasi. Sebahagian kemasukan yang kelihatan sebagai kemasukan metilena biru sebenarnya ialah kemasukan terpilih azure B. Kedua, pH menentukan hasil dengan menentukan keadaan pengionan, dan sel yang cedera membenarkan jauh lebih banyak pewarna masuk berbanding sel yang utuh. Pekali partisi dan keadaan cas menentukan bahan yang diserap oleh sistem buatan dan sel hidup, manakala persamaan antara kedua-duanya menyokong idea bahawa sempadan sel mempunyai lapisan bukan akueus.

Model itu mendahului zamannya dalam memahami lipid dan pengionan, tetapi tidak dapat membezakan pewarna yang mengalami pempartisian dalam bentuk asalnya daripada pewarna yang ditukar secara kimia di permukaan, merentasi membran dalam bentuk lain, lalu ditukar semula di dalam sel. Perbezaan itu memerlukan eksperimen yang berlainan, yang dijalankan tujuh puluh tahun kemudian pada endotelium paru-paru.

Penurunan di luar, pemerangkapan di dalam

Merker dan rakan-rakan menggunakan sel endotelium arteri pulmonari lembu yang dikultur dan mencadangkan urutan tiga langkah: pewarna teroksida diturunkan pada permukaan sel kepada bentuk lipofiliknya yang tidak berwarna, bentuk terturun meresap masuk, dan pengoksidaan semula intrasel menghasilkan semula bentuk teroksida yang tidak telap membran, lalu terkumpul. Kajian pengambilan tiazina oleh endotelium mereka(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9142941/) kemudian menguji urutan itu dengan cuba mengganggunya pada peringkat tertentu.

Alat pertama ialah ferisianida, penerima elektron yang tidak boleh memasuki sel. Apabila enzim permukaan menurunkan pewarna biru kepada bentuk tidak berwarna di luar sel, ferisianida boleh mengambil semula elektron tersebut, menghasilkan semula pewarna biru dalam medium sebelum ia sempat merentasi membran. Selagi ferisianida hadir secara berlebihan (10 micromolar pewarna berbanding 50 hingga 500 micromolar ferisianida), pengambilan pewarna hampir terhenti, dan hanya selepas ferisianida habis digunakan barulah pengambilan kembali berlaku pada kadar normal. Kinetiknya turut memberikan penjelasan yang sama melalui pemerhatian lain. Ferisianida berkurang pada kadar yang hampir malar, selaras dengan fluks penurunan permukaan yang stabil dan membekalkan elektron kepada pengantara yang boleh dikitar semula, manakala pewarna ekstrasel berkurang secara eksponen apabila kumpulannya menyusut. Fluks malar bersama kumpulan yang menyusut bermakna isyarat ferisianida menunjukkan penurunan berterusan, bukannya molekul pewarna yang meninggalkan larutan.

Alat kedua menyingkirkan sepenuhnya langkah merentasi membran. Kumpulan itu mengikat toluidina biru O, sebatian tiazina yang berkait rapat, pada rantai poliakrilamida besar yang terlalu besar untuk memasuki sel dalam mana-mana keadaan pengoksidaan. Sel masih menurunkan pewarna yang terikat itu. Oleh itu, penurunan tidak memerlukan akses ke bahagian dalam sel. Mekanismenya terdedah di permukaan atau terhubung secara elektrik dengannya.

Kemudian, eksperimen memisahkan proses-proses yang menjadi asas tajuk makalah itu. Sianida dan azida pada 2 millimolar sangat mengurangkan pengumpulan pewarna, dan di bawah mikroskop, inklusi biru gelap dan ungu yang biasanya mengelilingi nukleus hampir lenyap. Namun, kedua-dua perencat itu tidak memperlahankan penurunan ekstrasel: kitaran ferisianida berterusan tanpa berkurang dan polimer yang tidak menembusi membran masih diturunkan. Sekatan berlaku pada peringkat berikutnya. Sianida dan azida menghentikan pengoksidaan semula dan pengasingan intrasel, bukannya penurunan di permukaan. Kawalan daya hidup menyokong tafsiran ini, kerana sel mengekalkan enzim penanda sitosolnya, laktat dehidrogenase, sepanjang rawatan tersebut. Maka, kehilangan pengambilan itu bukan sekadar akibat keracunan atau pecahnya membran.

Satu peringatan daripada makalah itu masih terpakai. Inklusi biru berada di sekeliling nukleus, bukan di dalamnya, selaras dengan pengoksidaan dalam organel subsel, tetapi kajian itu tidak mengenal pasti organel yang terlibat. Corak serupa dalam jenis sel lain pernah dikatakan berlaku dalam lisosom berdasarkan bukti yang lemah. Anggap pemerangkapan itu sebagai sesuatu yang telah dibuktikan, tetapi lokasi tepatnya masih belum dipastikan. Pembaca yang menjejaki destinasi elektron seterusnya boleh meneruskan pembacaan tentang pengangkutan elektron mitokondria dan pengendalian redoks serta gambaran lebih luas tentang penyerapan dan pengagihan mengikut laluan.

Pewarnaan bukan pendedahan

Kajian ketiga menunjukkan apa yang berlaku apabila mekanisme pengambilan ini dikaitkan dengan ukuran biologi. Scott dan rakan-rakan mendapati bahawa metil beta siklodekstrin, molekul gula berbentuk torus atau gelang, mengikat metilena biru secara langsung, dengan pemalar perkaitan sekitar 310 per molar bagi kompleks inklusi berbanding kira-kira 5846 per molar bagi pendimeran pewarna. Dalam fibroblas L929, pengikatan ini menghalang kedua-dua pewarnaan sel dan rangsangan pengambilan glukosa: prainkubasi dengan siklodekstrin mencegah pewarnaan biru, manakala penambahannya selepas itu mempercepat penyahwarnaan. Apabila isyarat optik biru hilang daripada sel, pengangkutan glukosa yang telah diaktifkan turut menurun seiring dengannya.

Penulis mentafsirkan korelasi ini sebagai lebih menyokong interaksi langsung antara pewarna dengan suatu protein dalam laluan pengaktifan pengangkut glukosa, berbanding mekanisme tekanan oksidatif yang berpanjangan. Inferens itu munasabah, tetapi ada batasnya. Eksperimen tersebut tidak mengenal pasti protein berkenaan, tidak menunjukkan pengikatan pada pengangkut itu sendiri, dan korelasi antara penyahwarnaan dengan kehilangan kesan tidak dapat menolak semua laluan yang diperantarai redoks.

Pengajaran yang kekal relevan berkaitan dengan pengukuran. Pewarnaan optik menunjukkan pewarna yang kelihatan, teroksida dan berkaitan dengan sel. Ia langsung tidak mengesan kumpulan terturun yang tidak berwarna, jadi sel yang pucat masih boleh mengandungi setara pewarna, manakala sel yang diwarnakan dengan kuat menunjukkan pewarna teroksida yang terperangkap, bukannya jumlah pendedahan tisu atau magnitud kesan. Peringatan yang sama juga terpakai pada skala lebih besar: membandingkan pewarnaan antara jenis sel, atau menganggap keratan tisu yang gelap sebagai bukti pendedahan lebih tinggi, mengulangi kesilapan asal ketika memerhatikan piring sel. Pengambilan ialah kitaran penurunan, resapan dan pengoksidaan semula, dan sebarang gambaran tunggal bentuk biru hanya menunjukkan satu bahagian daripadanya. Implikasi praktikal untuk pewarnaan dan pengendalian makmal serta untuk mentafsir dakwaan dos dan pendedahan terbit secara langsung daripada hal ini.