Историјата на метиленското сино: од боја до лек и истражување

Метиленското сино стигнало до пациент пред да стигне до аптека.

Извештајот од 1891 на Paul Guttmann и Paul Ehrlich за употребата на бојата кај маларија содржи два температурни графикона. Вториот го опфаќа периодот од 13 July до 5 August, со третманот запишан долж маргината ден по ден. Записите за 18 и 19 July гласат „1 × 0,05 Methylenblau“. Следните денови наведуваат пет и седум дози од истата количина, а до 22 July во записот се појавува и мала количина кинин. Линијата на температурата, која во првата половина од графиконот осцилира меѓу 37 °C и 39.5 °C, се израмнува откако се појавува бојата и останува меѓу околу 36 °C и 37.5 °C во преостанатите три недели.

Пациентот бил еден од двајца, опишани во трудот како домашен слуга и морнар. Соединението што го примиле веќе петнаесет години било комерцијална текстилна боја, а двајцата мажи се меѓу првите забележани луѓе третирани со целосно синтетички лек насочен кон конкретен организам.

Бојата дојде прва

Првата комерцијално успешна синтетичка боја ја создал William Henry Perkin во 1856. Perkin имал осумнаесет години, работел во домашна лабораторија за време на велигденскиот распуст и се обидувал да синтетизира кинин. Наместо тоа добил црн остаток, го растворил и открил боја што извонредно се врзувала за свила. Ја патентирал во August 1856, а до крајот на 1857 имал фабрика што снабдувала лондонска бојадисувачница за свила.

Во 1875 Adolf von Baeyer синтетизирал црвена боја и ја нарекол eosin, според Eos, грчкиот збор за зора. Во 1876 Heinrich Caro, тогашен директор на лабораторијата во Badische Anilin- und Soda-Fabrik, заедно со Baeyer го развил метиленското сино како анилинска боја за памук. Неговата хемиска структура не била конечно утврдена сè до околу девет години подоцна.

Тоа потекло сè уште се гледа во начинот на кој супстанцијата се именува. „Methylene blue“ е трговско име од каталог на бои, а не хемиски опис. Соединението на кое се однесува е methylthioninium chloride, а разликите меѓу името, солта и нејзините хидрати стануваат важни веднаш штом некој го мери материјалот или чита спецификација.

Боењето беше мостот

Патот од фабриките за бои до болницата минувал преку микроскопот, а започнал уште пред да постои метиленското сино. Wilhelm Erb бил првиот што применил синтетичка боја на крв, користејќи пикринска киселина во 1865, и забележал ретикуларна шема во дел од црвените крвни клетки.

Докторската теза на Paul Ehrlich од 1878 го споредувала хистолошкото боење со боењето текстил и тврдела дека и двете се хемиски реакции. Работејќи под Robert Koch на бацилот на туберкулозата, тој ги поделил анилинските бои на кисели и базни класи и утврдил дека секоја класа обојува различни делови од клетката. Во 1880 ги измешал двете: заситен раствор од метиленско сино истуран во кисел fuchsin додека супернатантот не се избистрил. Резултатот, кој го нарекол neutralen Farbkörper или неутрално боење, создавал три бои наместо една, откривал гранули во полиморфонуклеарните клетки што дотогаш не биле видливи и го овозможил првото диференцијално броење на леукоцити. Бидејќи тие гранули ги врзувале двете компоненти од смесата, Ehrlich го создал зборот неутрофил за клетките што ги содржат.

Две години подоцна Koch употребил метиленско сино за да го открие бацилот на туберкулозата, а во 1883 Ehrlich го подобрил методот. Во 1886 објавил поинаков вид набљудување: ја инјектирал бојата во живи животни и споредувал колку силно ја презема секој орган, при што заклучил дека таа има изразен афинитет кон мозочното и нервното ткиво. Тој го припишал тој афинитет на оксидациско-редукциското циклирање на бојата, кое го забележал претходната година. Тоа циклирање е и причината поради која растворот на метиленско сино ја губи бојата кога кислородот ќе се потроши и повторно ја добива кога ќе се врати воздухот. Експериментите што први ги измериле последиците од тоа циклирање припаѓаат на подоцнежна деценија, а самиот механизам е посебна тема од историјата.

Паразитот и виолетовото јадро

Alphonse Laveran го открил паразитот на маларијата во 1880 испитувајќи свежа, необоена крв. За редовно да се гледа во исушен размасок било потребно боење, а тогашните бои создавале само црвена и сина боја.

Во 1888 полскиот патолог Czesław Cheçinski го заменил киселиот fuchsin со eosin, создавајќи смеса од метиленско сино и eosin. Случајот врз кој се засновал неговиот метод бил војник кој починал од маларија на 30 September 1887. Во крвните размаски Cheçinski видел сини форми слични на маргаритки, денес препознаени како Plasmodium malariae, и српести форми, денес препознаени како гаметоцити на Plasmodium falciparum. Резултатот истовремено ставил крај на две конкурентни објаснувања за болеста: теоријата за мијазма и тврдењето на Edwin Klebs и Corrado Tommasi-Crudeli дека маларијата ја предизвикува бактерија.

Паразитот бил видлив. Неговото јадро не било, што ја оставало неговата природа неразјаснета. Ernst Malachowski, лекар во Breslau, го решил тој проблем прво случајно, а потоа намерно. Во 1889 забележал диференцијално боење на плазмодијалното јадро во еден препарат и не можел повторно да го добие истиот резултат. Закиселувањето на метиленското сино не помогнало. Алкализирањето со borax го давало ефектот секојпат. Тој јавно ја демонстрирал техниката на 15 June 1890 и ја објавил истата година, а подетален метод објавил во August 1891.

Dmitri Romanowsky ја објавил сопствената верзија во September 1891. Најдобрите резултати ги добил од занемарено, мувлосано шише со раствор од метиленско сино стар повеќе од два месеци. Пристапот на Malachowski бил намерен и, според неговите зборови, лесно репродуцибилен; оној на Romanowsky бил ќорсокак што успеал еднаш. И покрај тоа, епонимот му припаднал на Romanowsky, а спорот околу тоа кој ја создал виолетовата боја што го направила јадрото видливо е посебна приказна со сопствени документи.

Слика: вториот температурен графикон од извештајот на Guttmann и Ehrlich од 1891. Горниот панел го опфаќа периодот од 13 до 24 July, а долниот од 25 July до 5 August; записите на маргината ги наведуваат дадените дози, а температурата останува близу нормалната во последните три недели од записот. Репродуцирано од извештајот скениран за Krafts, Hempelmann и Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Се покажа дека „созревањето“ е деметилација

Никој вклучен во работата во 1890-тите не знаел што му прави „созревањето“ на метиленското сино. Одговорот произлегол од индустриската хемија. Heinrich August Bernthsen го синтетизирал матичното соединение phenothiazine во 1883, во 1885 утврдил дека метиленското сино припаѓа на тоа семејство и во истиот период покажал дека алкалните услови отстрануваат метилни групи од бојата, создавајќи ги соединенијата што денес се нарекуваат azures.

Bernard Nocht ја издвоил активната фракција во 1898 и 1899 и можел да ја нарече само Rot aus Methylenblau, црвено од метиленско сино. Michaelis ја идентификувал како azure I во 1901. Jenner во 1899 вовел апсолутен метанол како растворувач за талогот од бојата, со што ја отстранил потребата крвните размаски да се фиксираат со загревање; Leishman и Reuter ги комбинирале двете подобрувања; Wright објавил поедноставен метод во 1902. Придонесот на Giemsa, исто така во 1902, бил да престане да се потпира на случајно созреан раствор и наместо тоа да користи измерени количини од познати бои. Потоа одбил да објави како произведува чист methylene azure и го продал методот на лабораторијата на Dr. Grübler, која го продавала производот како azure I и тврдела дека само нејзината верзија е автентично Giemsa боење.

Двете светски војни случајно ја довршиле работата. Кога германските бои станале недостапни, Lillie, Roe и Wilcox работеле на американските замени и откриле дека најдоброто боење се добива од три одделени компоненти: чисто метиленско сино, неговиот производ на разградување azure B, и eosin. Тие три и денес остануваат главните компоненти на боењето што се користи за дијагностицирање маларија, под име што сега ги обединува Malachowski, Wright и Giemsa.

Слика: прстенести форми на Plasmodium falciparum во човечки црвени крвни клетки, обоени со метод од типот Romanowsky. Виолетовата структура во внатрешноста на прстенот е хроматинот што метиленското сино третирано со borax кај Malachowski за првпат го направило видлив. Слика од Ernst Hempelmann, објавена во јавен домен.

Едно име, неколку материјали

Годините во кои тие компоненти се раздвојувале оставиле проблем што ја надживеал хемијата. Ralph Lillie во 1969 ја повлекол границата меѓу биолошките бои, „произведени според строги спецификации соодветни на нивната чувствителна и прецизна употреба“, и небиолошките бои за боење текстил, кои „бараат помалку строги и помалку захтевни производствени стандарди“. И двата вида производ го носеле истото име, а разликата меѓу нив никогаш не била само прашање на степен. Спецификација напишана за памук и спецификација напишана за дијагностички реагенс не се заменливи, а материјал произведен според текстилната спецификација не бил наменет за голтање.

Azure B е најјасниот пример. Тоа е монометилираната форма на метиленското сино, има сопствена мерлива фармаколошка активност и повеќе од еден век било присутно како неконтролирана компонента во клиничките препарати на метиленско сино пред некој да ги раздели двете. Една група открила дека човечко ткиво земено при обдукција по примена на метиленско сино содржело 5 до 14 per cent непроменето метиленско сино и 86 до 95 per cent azure B. Дали одреден препарат треба да содржи azure B и до која граница е прашање на спецификација, а истражувањата за azure B како нечистотија и метаболит продолжуваат од таму.

Практичната последица исто така лежи во спецификацијата. Усогласеноста со USP е патот до највисоката чистота што ја нуди пазарот, бидејќи станува збор за целосен објавен стандард за тестирање, а не за едно единствено мерење. Тој опфаќа идентитет, assay, органски нечистотии вклучувајќи ги azure боите, резидуални растворувачи, елементарни нечистотии, остаток по жарење, микробиолошки граници и бактериски ендотоксини. Сертификат што наведува резултат за тешки метали и го нарекува тоа усогласеност со USP прикажал само една ставка од таа листа.

Blupreme го набавува своето метиленско сино од фармацевтски производител и го објавува целосниот сертификат за анализа, тестирајќи ја целата USP спецификација наместо само тешките метали. Водичот за читање сертификат за анализа и што ознаката USP утврдува, а што не утврдува објаснуваат како документот да се провери во однос на тврдењето.

Што дозволува историјата да се заклучи, а што не

Континуитетот е реален и е подолг отколку што сугерираат повеќето страници за производи. Метиленското сино било употребено за третман на маларија во 1891, било пријавено како седатив кај агитирана психоза во 1899, а неговата странична хемиска линија се протега преку quinacrine, chloroquine, promethazine и chlorpromazine. Трудот на Ehrlich од 1890 со Arthur Leppmann опишал олеснување на невралгична и ревматска болка, а потоа ја разгледал и отфрлил можноста бојата да се тестира кај ментална болест.

Ништо од тоа не воспоставува современа употреба. Резултатот за маларија од 1891 се состоел од двајца пациенти и температурен графикон. Долгото познавање на една молекула е причина да се проучува, а не резултат само по себе. Историјата на соединението како лек и современите испитувања кај маларија одговараат на различни прашања од оние што ги поставувал Ehrlich, а крајните исходи мора да се читаат според нивните сопствени критериуми.

Во записите постои еден детал што му припаѓа на сегашното време, а не на минатото. Кога истражувачите спроведувале испитувања на метиленско сино за маларија во Burkina Faso во 2000-тите, се нашле во конкуренција за материјал од фармацевтски степен и пријавиле дека цената на суровината пораснала за фактор од околу сто откако добила GMP валидација. Бојата можела да се замени. Лекот не можел. Разликата што Lillie ја повлекол во 1969 е истата разлика што и денес одредува што содржи едно шише. :::