Експериментите што го поврзаа метиленското сино со клеточното дишење

Дефибринирана човечка крв, загреана на 37 °C во текот на три часа, троши околу два проценти од кислородот што го содржи. Ако пред инкубацијата се додаде мало количество метиленско сино, истата крв троши околу шеесет и пет проценти. Ништо во клетките не се променило. Се променил само растворот.

Тој број потекнува од труд од 1928 година на Џорџ Хароп и Е. С. Гузман Барон од „Џонс Хопкинс“ и е изворот на широко повторуваното тврдење дека метиленското сино го подобрува клеточното дишење. Тврдењето не е неточно, но има потесно значење отколку што звучи.

Што всушност мери бројот во табелата

Мерениот показател бил потрошувачката на кислород, утврдена со анализа на гасови. Хароп и Барон филтрирале свежо земена крв низ памучна вата на 10 °C за да ги отстранат белите крвни клетки, го заситиле примерокот со кислород, го поделиле, додале боја во едниот дел и ги анализирале двата дела по инкубацијата. Бројот на леукоцити ретко надминувал околу илјада на кубен милиметар. Потрошувачката на кислород била прикажана како удел од почетната содржина на кислород во примерокот што исчезнал.

Мереле и јаглерод диоксид, но тука методот им создавал тешкотии. Дефибринираната крв ослободувала до два милимола јаглерод диоксид на 100 mL во првиот час на инкубацијата, од причини што не биле поврзани со испитуваната реакција, па респираторните количници од целосната крв биле неупотребливи. Само измиените клетки во Локов раствор давале вредности што можеле да се толкуваат, а тие се движеле меѓу 0.73 и 0.80, и со бојата и без неа.

Тој детаљ не е ситница. „Дишење“ во овие трудови значи размена на гасови во затворен сад. Јазот меѓу потрошувачката на кислород и создавањето употреблива енергија е разгледан одделно во што ви кажува, а што не ви кажува потрошувачката на кислород за ATP.

Бојата најмногу додавала таму каде што клетките најмалку дишеле

Зрелите еритроцити на цицачите речиси немаат мерлива потрошувачка на кислород. Еритроцитите на птиците, кои имаат јадро, имаат. Хароп и Барон ги испитувале и едните и другите, а разликата е основата на нивниот аргумент.

Кај примероците од цицачи, бојата предизвикала дваесеткратно до педесеткратно зголемување. Во крвта од гуска, чии клетки веќе дишеле, таа никогаш не ја зголемила стапката повеќе од двојно. Колку било поголемо почетното дишење, толку помалку можела да додаде бојата.

Истата зависност се појавува и во рамките на еден вид. Човечки примерок од пациент со полицитемија вера, кој содржел незрели клетки, потрошил 11.3 проценти од својот кислород без присуство на бојата, наспроти 2.8 проценти кај измиените клетки од здрав дарител. Со бојата потрошувачката достигнала само 63.4 проценти — шесткратно забрзување, додека кај нормалните клетки забрзувањето било речиси триесеткратно. Бојата ги насочувала зрелите клетки кон однесувањето на незрелите, токму како што тврделе авторите.

Цијанидот требало да го запре тоа

Било познато дека цијанидот ја запира клеточната оксидација. Хароп и Барон сепак го додале заедно со бојата.

Резултатите со говедска крв се репрезентативни. Без никакви додатоци, содржината на кислород паднала од 22.61 на 22.03 волуменски проценти во текот на три часа. Со метиленско сино паднала на 12.84. Со метиленско сино и калиум цијанид во моларна концентрација од една петилјадитина, паднала на 12.74. Ефектот на бојата останал практично непроменет.

Слика: континуиран микрореспирациски запис на човечки еритроцити. Стрелката го означува додавањето метиленско сино. Пред него, кривата е речиси рамна; потоа постојано се искачува. Преземено од Хароп и Барон, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Нивниот заклучок бил дека бојата дејствува како носач на кислород, „обезбедувајќи супстанција што исчезнала од зрелите еритроцити без јадро кај цицачите“. Две години подоцна, Михаелис и Саломон од Институтот „Рокфелер“ го формулирале несогласувањето во облик што останал траен. Или ефектот на бојата бил „случајно својство на бојата“, или бојата била „модел за некоја непозната супстанција во организмите“. Тоа прашање меѓу двете можности сè уште не е разрешено. Она што се променило е дека клетките сега можат да се опишат многу попрецизно.

Екстракт од црн дроб го правел истото

Михаелис и Саломон покажале дека екстракти од органи добиени со ладна вода го предизвикуваат истото поттикнување. Црниот дроб од стаорец имал најсилен ефект, по него следувале бубрегот, слезината и тестисот. Мозокот, мускулите и крвниот серум имале мал или никаков ефект.

Потоа го испитале екстрактот во присуство на јаглерод моноксид. Дишењето предизвикано од екстрактот или од бојата останало непроменето во мешавина од 98 проценти јаглерод моноксид и 2 проценти кислород. Истата гасна мешавина го инхибирала дишењето на квасецот и на еритроцитите со јадро кај кокошките за приближно 60 до 80 проценти, во согласност со Варбурговиот опис на респираторен фермент чувствителен на јаглерод моноксид. Затоа неидентификуваната ткивна супстанција не била Варбурговиот ензим.

Во текот на истражувањето биле отфрлени неколку можни идентитети. Редуцираниот глутатион и цистеинот предизвикувале само потрошувачка на кислород потребна за нивната сопствена оксидација. Коензимот на Харден и Јанг бил исклучен затоа што мускулите го содржат во најголемо количество, а покажувале речиси најмал ефект. Кејлиновиот цитохром, именуван неколку години порано, се соочил со истата противречност. Својата сопствена претпоставка, дека активната супстанција потекнува од клеточното јадро, ја нарекле само претпоставка.

Ефектот зависел од одредени услови

Клетките морале да бидат недопрени. Хемолизата со дестилирана вода или со повторено замрзнување го укинувала одговорот и на бојата и на екстрактот, а делумната хемолиза пропорционално го намалувала.

Бил потребен и шеќер. Глукозата, фруктозата и сахарозата го поддржувале дишењето предизвикано од бојата; манитолот не го поддржувал. Без присуство на шеќер воопшто немало дишење, а се чинело дека бојата притоа ги оштетува клетките, па глукозата додадена еден или два часа подоцна не го обновувала. Авторите претпоставиле дека бојата оксидира структурна компонента што ѝ е потребна на клетката.

Осветлувањето значително го зголемувало ефектот на бојата, иако ефектот бил јасен и во темнина. Другите бои што можат да се редуцираат се однесувале поинаку: толуиленското сино го достигнувало или го надминувало ефектот на метиленското сино, додека индиго дисулфонатот речиси немал ефект. Не се појавила јасна врска меѓу оксидациско-редукцискиот потенцијал на бојата и големината на нејзиниот ефект, што авторите го припишале на пропустливоста на мембраната и на токсичноста.

Ефектот ја следел ферментацијата, а не дишењето

Студијата на Барон од 1930 година преминала од клеточни суспензии на ткивни исечоци од нормални органи на стаорци и од трансплантирани тумори.

Во ткивата без аеробна гликолиза, метиленското сино немало ефект или малку ја намалувало потрошувачката на кислород: кај бубрегот за околу 14 проценти, кај панкреасот за околу 14 проценти, кај црниот дроб за околу 5 проценти. Во ткивата што ферментираат во присуство на кислород, ја зголемувало потрошувачката: кај слезината за околу 8 проценти, кај мозокот за околу 13 проценти. Зголемувањата кај туморите се движеле од околу 27 проценти кај човечки карцином на дојка до повеќе од 80 проценти кај Раусов сарком кај кокошка, приближно пропорционално на аеробната гликолиза на секое ткиво.

Слика: секоја точка претставува еден вид ткиво. Хоризонталната оска е аеробната гликолиза; вертикалната оска е промената во потрошувачката на кислород по додавањето метиленско сино. Податоци од Барон, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Табела 6, PMID 19869777.

Експериментот со цијанид потоа ја дал обратната слика. Кога дишењето во тие претходно неодговорни ткива било блокирано со цијанид и ферментацијата дошла до израз, бојата повторно ја зголемила потрошувачката на кислород: кај бубрегот за околу 59 проценти, кај црниот дроб за околу 19 проценти, кај слезината за околу 286 проценти, кај тестисот за околу 200 проценти.

Барон предложил дека бојата може да служи како тест за ферментативниот капацитет на клетка или ткиво и завршил со претпоставка: култивирањето тумори низ повеќе генерации во медиум што содржи боја можеби еден ден трајно би го направило метаболизмот на туморот сличен на оној на нормалното ткиво. Тоа било истражувачко прашање напишано во 1930 година. Не е тврдење за лекување.

Што експериментите не можеле да мерат

Во 1928 и 1930 година, „дишење“ значело потрошувачка на кислород. Аденозин трифосфатот првпат бил опишан во 1929 година, а доказот дека изолираните митохондрии естерифицираат фосфат додека пренесуваат електрони се појавил во 1949 година. Ниту еден од раните трудови за метиленското сино не можел да го мери создавањето енергија, и ниту еден не тврдел дека го мери.

Клетките се вториот проблем. Зрелите еритроцити на цицачите не содржат митохондрии. Во стадиумот на ретикулоцит, тие ги отстрануваат митохондриите и рибозомите преку селективна автофагија, поради што зрелата црвена крвна клетка се потпира на гликолизата и зависи од својот пентозофосфатен пат главно за NADPH, а не за ATP. Во експериментите од 1928 година немало присутен синџир за транспорт на електрони што би можел да се поправи. Што и да го трошело кислородот, правело нешто друго.

Денес тоа нешто друго е прилично добро опишано. Метиленското сино прифаќа електрони од клеточните редукциски еквиваленти и станува леукометиленско сино, кое повторно се оксидира со молекуларен кислород, затворајќи го циклусот. Во човечките еритроцити, флавин редуктазата зависна од NADPH и сродните дисулфидни редуктази го изведуваат чекорот на редукција. Студија од 1976 година со означена глукоза утврдила дека бојата го поттикнува хексозомонофосфатниот шант, дека ефектот при ниска концентрација зависи од оксихемоглобинот и дека повисока концентрација, 0.1 mM, создава водород пероксид. Редуцирана боја што доаѓа во допир со кислород создава пероксид, а не фосфатни врски.

Кај митохондриите, сликата е поспорна отколку што признаваат популарните прегледи. Една насока на истражување смета дека бојата зема електрони од подрачјето на комплекс I и ги предава на цитохром c. Друга утврдила дека во митохондрии од мозок на глушец таа не може да го обнови дишењето по блокада со антимицин и наместо тоа го сместила местото на прифаќање електрони на местото за врзување убихинол во комплекс III. Трета утврдила дека ниските концентрации ја зголемуваат потрошувачката на кислород во мирување, додека дишењето поттикнато со ADP останува непроменето. Најдиректната формулација на поентата е дека потрошувачката на кислород предизвикана од метиленско сино воопшто не зависи од оксидативната фосфорилација: таа продолжила кога респираторниот синџир бил инхибиран, како и во препарати без таков синџир.

Постојат и директни мерења на јазот меѓу двете величини. Во изолирани митохондрии од црн дроб на стаорец, зголемувањето на концентрацијата на бојата ги намалувало коефициентите на респираторна контрола и предизвикувало набабрување, што авторите го опишале како раздвојување на оксидативната фосфорилација. Во перфузиран црн дроб на стаорец, метиленското сино ја зголемувало потрошувачката на кислород, додека соодносот ATP–ADP опаѓал.

Клиничките податоци ја носат истата порака. Метхемоглобинемијата се лекува со приближно еден до два милиграма метиленско сино на килограм, интравенски, преку редукциски пат зависен од NADPH, а поголемите дози ја предизвикуваат состојбата што се лекува. Истиот преглед забележува дека антидотниот ефект е најголем во недопрени еритроцити и се намалува кога е присутна хемолиза, што е повторна појава на наодот за хемолиза од 1930 година, седумдесет и три години подоцна во болнички контекст. Соединение чии корисни и штетни ефекти лежат на спротивните страни на дозен праг не е соединение чија доза треба да се заклучува од мерење на потрошувачката на кислород.

Зошто серијата е дел од дискусијата

Хароп и Барон забележале нешто што вреди повторно да се прочита. Самото метиленско сино создава лента во спектроскопот меѓу двете карактеристични ленти на метхемоглобинот, „што лесно може да предизвика забуна при површен преглед“. Бојата може да ја имитира супстанцијата што се бара.

Истиот проблем има и хемиски облик. Сроден фенотијазин присутен како споредна состојка има сопствено редокс-однесување, сопствена пропустливост и сопствена токсичност. Еден документиран случај конкретно покажува зошто е тоа важно: во студија за јодирање на метиленско сино, примероци што содржеле приближно 7 до 8 проценти Azure B произвеле главно јодиран Azure B, па во реакцијата доминирала нечистотијата, а не метиленското сино.

Секој што користи метиленско сино како реагенс, во лабораторија, на работна маса за боење препарати или во аквариум, работи со состојка со неутврдени својства ако серијата не е карактеризирана. Сродните супстанции, идентитетот, елементните нечистотии, резидуалните растворувачи и остатокот по жарење се дел од експериментот, а не само придружна документација. Blupreme го набавува своето метиленско сино од фармацевтски производител и објавува целосен сертификат за анализа, со испитување на целосната USP спецификација, а не само на тешките метали; водичот за читање сертификат за анализа и што потврдува, а што не потврдува ознаката за USP квалитет објаснуваат како да го проверите документот во однос на тврдењето.

Бројот бил точен

Експериментите од 1928 и 1930 година биле внимателно спроведени, а нивното главно согледување останало валидно: боја што може да се редуцира може да натера клетка што речиси не дише да троши кислород со стапка многукратно поголема од нејзината стапка во мирување, без да поминува низ чекорот што го блокира цијанидот.

Грешката се појавува подоцна, кога „дишење“ се чита со неговото современо значење. Мерењето на размената на гасови ви кажува дека електроните стигнале до кислородот. Не ви кажува дека некои од нив биле искористени за создавање ATP, а во клетка без митохондрии растојанието меѓу тие две тврдења е најголемо што може да биде. Пошироката карта на дејството на метиленското сино во клетките ја поставува истата разлика во поширока рамка, а историјата на соединението од боја до лек објаснува како една текстилна боја воопшто стигнала до овие експерименти.