Metilēnzilais un mitohondriji: elektronu transports un pierādījumi

Iztēlojieties divus preparātus blakus. Abos ir smadzeņu mitohondriji, kas saindēti ar rotenonu — ķīmisku vielu, kura bloķē elpošanas ķēdes I kompleksu. Vienā no tiem eksperimentētājs ar pipeti pievieno metilēnzilo mikromolārā koncentrācijā. Skābekļa patēriņš daļēji atjaunojas. Membrānas potenciāls daļēji atgriežas. Atsākas neliela ATP sintēze. Blakus kivetē peroksīda sensors atklāj stāsta otru pusi: ūdeņraža peroksīda izdale ir palielinājusies vairākas reizes — pie katras pārbaudītās devas un ar katru izmēģināto substrātu.

Abi mērījumi ir pareizi. Metilēnzilais ir elektronu pārnesējs, kas var uzturēt plūsmu, apejot bojātu elpošanas ķēdes posmu, taču par šo pārnesi jāmaksā ar peroksīda veidošanos. Paturot prātā abus faktus vienlaikus, literatūra par metilēnzilā ietekmi uz mitohondriju darbību kļūst saprotama. Paturot prātā tikai vienu, tā izklausās pēc brīnuma vai drauda atkarībā no tā, kuru publikāciju atvērāt pirmo.

Elektronu pārnese vienkāršiem vārdiem

Elpošanas ķēde ir secīgu nodošanas posmu virkne. Elektroni ienāk caur I kompleksu (no NADH) vai caur II kompleksu un saistītiem flavīnu enzīmiem (no sukcināta un līdzīgiem donoriem), tālāk caur III kompleksu nonāk pie mobilā pārnesēja citohroma c un pēc tam caur IV kompleksu — pie skābekļa. Katrā nodošanas posmā protoni tiek sūknēti pāri iekšējai membrānai, un izveidotais gradients nodrošina ATP sintēzi. Bloķējot jebkuru posmu, iepriekšējā ķēdes daļā plūsma apsīkst.

Metilēnzilais iesaistās kā paralēls kurjers. Tā oksidētā forma uzņem elektronus no iepriekšējo posmu pārnesējiem un kļūst par bezkrāsaino reducēto formu — leikometilēnzilo. Tas savukārt nodod elektronus tālāk uz nākamajiem posmiem un atkal kļūst zils. Abas formas ir aprakstītas skaidrojumā par redokspāri, savukārt plašāks šīs pārneses raksturojums sniegts vispārīgajā darbības mehānisma skaidrojumā. Atklāts paliek jautājums, kur kurjers atgriežas ķēdē: III kompleksa hinola saistīšanās kabatā, kas pazīstama kā Qo vieta, vai tieši pie citohroma c. Tas, kurš nodošanas ceļš dominē, ir atkarīgs no apstākļiem, kā detalizēti izklāstīts III kompleksa apiešanas analīzē.

Ko patiesībā mērīja trīs pētījumos ar grauzējiem

Visos trīs pētījumos izmantoja izolētus smadzeņu mitohondrijus, proti, organoīdus, kas izņemti no šūnas un suspendēti noteikta sastāva buferšķīdumā. Nebija neskartu šūnu, dzīvnieku, kuriem ievadīta viela, vai cilvēku pētījuma dalībnieku. Koncentrācijas attiecas uz šķīdumu ap organoīdiem, nevis uz cilvēkam iekšķīgi lietojamu devu. Paturot šo ietvaru nemainīgu, skaitļi runā skaidri.

Pirmajā pētījumā ar izolētiem jūrascūciņu smadzeņu mitohondrijiem pie koncentrācijām no 100 nanomoliem litrā līdz 2 mikromoliem litrā vienā preparātā noteica gan ieguvumu, gan tā cenu. Veselos mitohondrijos krāsviela palielināja skābekļa patēriņu miera stāvoklī, taču nemainīja ADP stimulētu elpošanu, tāpēc ar elpošanu saistītā ATP ražošana neuzlabojās. I kompleksa blokādes apstākļos 2 mikromoli litrā atjaunoja ATP sintēzi no 46 līdz 93 nanomoliem minūtē uz miligramu, salīdzinot ar normālo ātrumu aptuveni 1109. III kompleksa blokādes apstākļos tā pati deva atjaunoja ATP sintēzi no aptuveni 46 līdz 63, salīdzinot ar normālo ātrumu aptuveni 910. Membrānas potenciāls un kalcija uzņemšana daļēji atjaunojās. Cianīda izraisīto IV kompleksa blokādi apiet nevarēja, kas nozīmē, ka lietderīgā elektronu nodošanas vieta atrodas pirms funkcionējoša IV kompleksa. Katrs darbības atjaunošanās efekts bija statistiski nozīmīgs, bet neliels: viencipara procentu daļa no normālās ATP ražošanas.

Otrajā pētījumā ar peļu smadzeņu garozas mitohondrijiem pie aptuveni 1 mikromola litrā apstiprināja I kompleksa apiešanu un iezīmēja robežu pie III kompleksa. Rotenons samazināja elpošanu no aptuveni 121 līdz mazāk nekā 2 nanomoliem skābekļa minūtē uz miligramu, un krāsviela to palielināja līdz aptuveni 21 — apmēram vienai sestdaļai no normālā līmeņa —, kamēr membrānas potenciāls atjaunojās gandrīz pilnībā. Taču pēc III kompleksa bloķēšanas ne elpošana, ne membrānas potenciāls neatjaunojās koncentrāciju diapazonā no 1 līdz 5 mikromoliem litrā, un blokāde nomāca krāsvielas izraisīto peroksīda signālu. Autori izvirzīja pieņēmumu, ka reducētā krāsviela nodod elektronus III kompleksa Qo vietā: ja šī vieta ir aizņemta, kurjeram nav kur nodot kravu.

Trešajā pētījumā ar peļu, žurku un jūrascūciņu smadzeņu mitohondrijiem, galvenokārt pie 2 mikromoliem litrā, šo pretrunu pārbaudīja tieši un konstatēja, ka III kompleksa blokādi var apiet. Kad Qo vietas inhibitors miksotiazols samazināja bazālo elpošanu par 88 procentiem, krāsviela atjaunoja skābekļa patēriņu līdz aptuveni 62 procentiem no nebloķētā līmeņa. Tiešā pārbaudē pusmikromolāra krāsvielas koncentrācija reducēja ārēji pievienotu citohromu c pat tad, kad III komplekss bija bloķēts, tādējādi atbalstot ceļu no NADH caur krāsvielu uz citohromu c un tālāk uz IV kompleksu. Taču atjaunotā elpošana uzvedās neparasti: pievienotais ADP samazināja skābekļa patēriņu, nevis palielināja to, un ATP sintēzes bloķēšana stimulēja elpošanu. Membrānas potenciāls atjaunojās tikai daļēji. Liels skābekļa patēriņš ar pretēju elpošanas un ATP sintēzes sasaistes reakciju nav normāla enerģijas ražošana.

Kāpēc laboratoriju rezultāti atšķiras un kas to izskaidro

Skaidrojums ar sugu atšķirībām neiztur pārbaudi. Trešā grupa atkārtoja darbu ar trim grauzēju sugām un visās ieguva kvalitatīvi vienādu apiešanas efektu, tostarp tajā peļu līnijā, kurā iepriekš bija ziņots par šī efekta neesamību. Tā vietā atšķiras koncentrācija (1 pret 2 mikromoliem litrā), inhibitoru devas, buferšķīdumi, izolēšanas metodes un galvenokārt salīdzinātais enerģētiskais stāvoklis: apiešana visskaidrāk redzama pirms ADP pievienošanas, tieši tur, kur parādās paradoksālā reakcija uz ADP. Tāpēc korektā shēmā jāparāda divi no apstākļiem atkarīgi elektronu nodošanas ceļi — viens pie Qo vietas un otrs pie citohroma c. Kurjers nodod kravu tur, kur to ļauj vietējie ķīmiskie apstākļi.

Peroksīda cena

Izmaksu puse ir tikpat konsekventa kā darbības atjaunošanās puse. Pētījumā ar jūrascūciņām krāsviela palielināja peroksīda izdali visos pārbaudītajos apstākļos — miera stāvoklī, ATP sintēzes laikā un ķīmiski traucētas darbības apstākļos — ar visiem trim substrātiem. ATP sintēzes laikā pie 1 mikromola litrā izdale pieauga no aptuveni 148 līdz vairāk nekā 1500 pikomoliem minūtē uz miligramu, un pat 100 nanomoli litrā palielināja signālu vairāk nekā četrkārtīgi. Krāsviela arī palēnināja peroksīda noārdīšanu aptuveni 2.6 reizes, tāpēc signāls atspoguļo gan ātrāku veidošanos, gan lēnāku izvadīšanu. Piedāvātais ķīmiskais skaidrojums ir tieša skābekļa reducēšana ar reducēto krāsvielu bez nosakāma superoksīda, lai gan tā joprojām ir interpretācija, nevis pierādīts reakcijas posms.

Pētījums ar pelēm ainu lietderīgi sarežģī. Peroksīda izdale strauji pieauga līdz ar devu — no sākotnējā līmeņa ap 76 līdz gandrīz 2000 pikomoliem minūtē uz miligramu pie 2 mikromoliem litrā —, tomēr III kompleksa blokāde nomāca krāsvielas izraisīto komponenti. Ja peroksīds rastos tikai reducētās krāsvielas reakcijā ar skābekli, ķēdes bloķēšanai nevajadzētu būt tik lielai nozīmei. Taču tāda ir, tātad procesā piedalās arī ķēde. Antioksidantu un prooksidantu darbības pārskats aplūko šo divējādību plašākā kontekstā, savukārt skābekļa patēriņa un ATP analīze skaidro, kāpēc skābekļa patēriņa skaitļi vien nekad nepierāda apgalvojumu par enerģijas ražošanu.

Darbības atbalsts nav bojājumu novēršana

Frāze, no kuras būtu jāatsakās, ir "vai metilēnzilais atjauno mitohondrijus". Bojājumu novēršana nozīmētu ilgstošu korekciju: atjaunotus kompleksus, elpošanas un ATP sintēzes sasaisti, kas saglabājas pēc vielas aizvadīšanas, darbības atjaunošanos neskartās šūnās un pēc tam uzlabotu darbību dzīvā organismā. Neviena no trim publikācijām to neparāda. Tās parāda tūlītēju elektronu plūsmas pārvirzīšanu svaigi izolētos organoīdos mākslīgi izraisītas ķīmiskas blokādes laikā, ar ATP ražošanu nelielā daļā no normālā līmeņa un dažkārt pavisam neparastu sasaisti. Rotenons un antimicīns ir laboratorijas rīki, nevis novecošanas vai cilvēku mitohondriālo slimību modeļi, un nekas šeit nenozīmē vairāk enerģijas veselam cilvēkam. Tas ir atsevišķs jautājums par pierādījumiem, kam ir sava pētījumu literatūra par cilvēkiem.

Trīs ierobežojumi palīdz saglabāt jebkuru biohakinga secinājumu korektu. Pirmkārt, koncentrācija šķīdumā nav deva: 0.1 līdz 2 mikromoli litrā ap izolētiem organoīdiem neko nepasaka par to, kāds iekšķīgi lietots daudzums radītu šādu brīvās vielas koncentrāciju pie cilvēka smadzeņu mitohondrija, jo īpaši tāpēc, ka krāsviela uzkrājas vai atbrīvojas atkarībā no paša membrānas potenciāla. Otrkārt, skābeklis nav enerģija: krāsviela var palielināt skābekļa patēriņu gan ar cikliskām reakcijām un elektronu noplūdi, gan ar produktīvu fosforilēšanu, tāpēc respirometrija bez ATP un membrānas potenciāla mērījumiem nevar pamatot apgalvojumu par enerģiju. Treškārt, ieguvumam un slogam jābūt vienā teikumā: jebkurš apgalvojums par atjaunotu membrānas potenciālu vai ATP, kurā nav minēts vienlaicīgais peroksīda pieaugums, atspoguļo eksperimentu nepareizi. Saistītie precizējumi ietver NAD redokslīdzsvaru, devas un atbildes reakcijas līknes formu un mērījumu metožu ceļvedi.

Viena praktiska piebilde: elektronu pārnese ir konkrētās molekulas īpašība. Arī demetilētie radniecīgie savienojumi, piemēram, Azure B, ir redoksaktīvi, taču tiem ir atšķirīga darbība, tāpēc eksperiments ar daļēji noārdījušos šķīdumu atšķiras no eksperimenta ar neskartu krāsvielu. Tas ir viens no iemesliem prasīt atbilstību pilnai farmakopejas specifikācijai un publicētu partijas dokumentu, nevis tikai metālu pārbaudi. Gaismas izraisītās ķīmiskās reakcijas rada papildu apsvērumu izmantošanai apgaismojumā; tas aplūkots sadaļā par kombinācijām ar sarkano gaismu.

Šaurais apgalvojums iztur visus šos apsvērumus un ir saglabāšanas vērts: noteiktos apstākļos metilēnzilais var darboties kā elektronu kurjers bojātos, izolētos mitohondrijos, daļēji saglabājot plūsmu uz peroksīda veidošanās rēķina. Visam, kas sniedzas tālāk — enerģijai, ilgmūžībai, bojājumu novēršanai —, vēl vajadzīgi pierādījumi, kurus šie pētījumi nekad nebija paredzēti sniegt.