Metileno mėlynasis smegenų pažeidimams: kaip suprasti ikiklinikinius įrodymus

Smūgis į galvą, užsikimšusi arterija ir lėtai progresuojanti neurodegeneracinė liga gali baigtis ta pačia problema: smegenims nebepakanka energijos savo darbui atlikti. Dėl šios bendros baigties tas pats junginys vis pasirodo visų trijų sričių mokslinėje literatūroje. Tačiau bendra baigtis nereiškia tos pačios tyrimo sampratos. Gydymas, skiriamas prieš pažeidimą, gydymas, skiriamas per valandą po jo, ir gydymas, kurio rezultatai vertinami po kelių mėnesių, tikrina skirtingas idėjas, net jei švirkšte yra tas pats mėlynas skystis.

Šiame straipsnyje nagrinėjama su pažeidimais susijusi šios literatūros dalis. Apžvelgiama, ką metileno mėlynojo naudojimas smegenų pažeidimams reiškia eksperimentuose su gyvūnais, atskiriamas trauminis pažeidimas nuo insulto ir lėtinės neurodegeneracijos bei parodoma, kodėl dozės skyrimo laikas paaiškina daugumą tyrimų skirtumų.

Trys pažeidimai, vienas energijos gamybos sutrikimas

Šiuos modelius siejantis mechanizmas veikia mitochondrijose. Įprastai elektronai perduodami elektronų pernašos grandine, kad būtų gaminamas ATP, o tinkamai veikianti grandinė padeda kontroliuoti reaktyviąsias deguonies formas. Po pažeidimo kai kurios grandinės dalys ima veikti prasčiau, ATP gamyba sumažėja, o laisvųjų radikalų gamyba padidėja. 2018 m. „Molecular Neurobiology“ apžvalgoje metileno mėlynasis aprašomas kaip alternatyvus elektronų nešiklis: jis priima elektronus iš NADH ir perduoda juos citochromui c, taip padidindamas IV komplekso aktyvumą ir atkurdamas ATP sintezę net tada, kai pradinė grandinės dalis yra pažeista.

Pateikti skaičiai yra konkretūs. Ląstelių ir audinių pjūvių preparatuose IV komplekso aktyvumas padidėjo nuo 30 iki 100 procentų, o deguonies suvartojimas didėjo kartu. Tai rodo, kad papildomi elektronai atliko naudingą darbą, o ne nutekėjo sudarydami radikalus. Žiurkių insulto modelyje ATP gamyba paveiktoje srityje praėjus 24 valandoms po gydymo buvo maždaug 30 procentų didesnė nei negydytų gyvūnų. 2022 m. „Biochemistry (Moscow)“ apžvalgoje papildomai aprašomos tolesnės pasekmės: mažesnis oksidacinis stresas, mažesnis neurouždegimas, mažesnė apoptozė, taip pat poveikis monoaminooksidazei, azoto monoksido sintazei, mitochondrijų biogenezei, autofagijai ir netaisyklingai susilanksčiusių baltymų agregacijai.

Taigi samprata paprasta. Pažeidimas sutrikdo įprastą elektronų kelią, o metileno mėlynasis suteikia aplinkkelį. Visa kita priklauso nuo to, koks pažeidimas tiriamas, kada skiriamas junginys ir kaip vertinami rezultatai.

Trauminis pažeidimas nėra insultas

Trauminio smegenų pažeidimo modelyje jėga paveikia staiga. Pirminis pažeidimas yra mechaninis: audiniai plyšta, kraujagyslės trūksta, o kraujo ir smegenų barjero pralaidumas padidėja per kelias minutes. Metileno mėlynasis galėtų veikti vėliau, per kelias valandas ir dienas, kylančią antrinę bangą, kai išlikusių audinių mitochondrijos ima veikti prasčiau, plinta uždegimas ir didėja edema. Šių tyrimų vertinimo rodikliai atspindi tokią seką: pažeidimo tūris, vandens kiekis smegenyse, neuronų išlikimas netoli smūgio vietos ir vėlesnis elgesys, pavyzdžiui, motorinių funkcijų atsigavimas ar mokymasis labirinte.

Insulto ar globalios išemijos modelyje žalingo poveikio pobūdis kitoks. Kraujotaka nutrūksta, per kelias minutes sutrinka energijos gamyba, o atkūrus kraujotaką atsiranda papildomas reperfuzinis pažeidimas. Čia dozės skyrimas derinamas prie kraujagyslės įvykio, dažnai per kelias minutes po okliuzijos ar reperfuzijos, o vertinimo rodikliai kiekybiškai apibūdina ūminę audinių baigtį per kelias valandas ar vieną–dvi dienas: infarkto dydį, kraujotaką ir ankstyvą funkcinį atsigavimą. Vienas insulto literatūroje pasikartojančių metodų yra išankstinis skyrimas, kai gyvūnai dozę gauna prieš kraujagyslės okliuziją. Taip tikrinama prevencija tokiu būdu, kurio joks galvos traumos eksperimentas negalėtų etiškai atkartoti žmonėms.

Insulto tyrimų rezultatai yra stipriausi pažeidimų literatūroje, tačiau tarp jų yra ir aiškiausias poveikio nebuvimo rezultatas. Žiurkėms, kurioms metileno mėlynasis buvo skirtas reperfuzijos metu po vieną valandą trukusios vidurinės smegenų arterijos okliuzijos, 2 dieną nustatyti 30 procentų mažesni infarktai, išsaugant didesnę grėsmę patyrusių infarkto branduolio ir penumbros audinių dalį (Shen, 2013). Nuolatinės okliuzijos tyrime nustatytas lėtesnis grėsmę patyrusių audinių virtimas infarktu, tačiau nė viena iš dviejų tirtų dozių nesumažino galutinio infarkto tūrio po 24 valandų (Rodriguez, 2014). Trečiame okliuzijos tyrime vidutinė dozė sumažino infarkto dydį maždaug perpus; mitochondrijų ultrastruktūra ir mitofagija buvo tiesiogiai tirta išeminėse smegenyse. Kartu pranešta apie iš pirmo žvilgsnio nelogišką detalę: išmatuota apoptozė didėjo, nors nekrozė mažėjo (Di, 2015). O globalios išemijos atveju nuolatinė mažos dozės infuzija atkūrė citochromo c oksidazės aktyvumą, ATP lygį ir mitochondrijų membranos potencialą pažeidžiamoje hipokampo CA1 srityje, išsaugojo jos neuronus ir apsaugojo erdvinę atmintį (Lu, 2016). Ties šiuo CA1 matavimu verta stabtelėti: tai tiesioginiai ATP ir kvėpavimo grandinės duomenys iš pažeistų smegenų, o TBI literatūroje šie procesai dažniausiai numanomi, ne matuojami.

Lėtinė neurodegeneracija skiriasi nuo abiejų. Alzheimerio, Parkinsono ir Huntingtono ligų modeliuose gyvūnams dozės skiriamos savaites ar mėnesius, o vertinama baltymų agregacija, dopamino apykaita ar laipsniškas pažintinių funkcijų silpnėjimas. Šie rodikliai beveik neturi nieko bendra su pažeidimu, išmatuotu praėjus kelioms dienoms po smūgio. Skaitytojai, perkeliantys vienos srities rezultatą į kitą, perkelia išvadą per ribą, kurios eksperimentai niekada neperžengė. Mūsų neurodegeneracijos literatūros vadove šie ilgos trukmės tyrimai nagrinėjami atskirai, o palyginime su tik insulto tyrimų įrodymais išsamiai atskiriamos kraujagyslių užsikimšimo ir smūgio tyrimų schemos.

Kas iš tiesų atlikta TBI modeliuose

Nėra paskelbta nė vieno metileno mėlynojo klinikinio tyrimo su žmonėmis, patyrusiais trauminį smegenų pažeidimą. Visą TBI duomenų visumą sudaro tyrimai su gyvūnais, daugiausia žiurkėmis ir pelėmis. Ji telkiasi apie nedidelį eksperimentų rinkinį, kuriuos verta įvardyti, nes jų detalės skiriasi taip, kaip apibendrinimai dažnai neparodo.

Ankstyviausiame kontroliuojamo smūgio į smegenų žievę tyrime žiurkėms į veną skirta 1 mg/kg praėjus vienai valandai po lengvo smūgio, vėliau – 0.5 mg/kg praėjus trims valandoms (Watts, 2014). MRI nustatytas pažeidimo tūris gydytų gyvūnų grupėje išliko mažesnis per dvi stebėjimo savaites. Ėjimo teste letenų pastatymo klaidų reikšmingai sumažėjo 1, 2 ir 7 dienomis, bet ne 14 dieną. Mikroskopu 14 dieną pažeistoje žievėje viename regėjimo lauke suskaičiuota 270 degeneruojančių neuronų, palyginti su 368, o nenormaliai pagal Nissl nusidažiusių neuronų – 41, palyginti su 73. Kitaip tariant, nustatyta ankstyva apsauga, tačiau elgesio rodiklių pranašumas antrą savaitę silpnėjo.

Difuzinio pažeidimo tyrime pelėms taikyta skysčio perkusija ties vidurio linija ir per pusvalandį į veną skirta vienkartinė 2 mg/kg dozė (Fenn, 2015). Gydytiems gyvūnams nustatyta silpnesnė su uždegimu susijusių genų raiška, mažiau uždegimiškai aktyvuotų mikroglijos ląstelių, mažiau pastebima edema ir į depresiją panašaus elgesio nebuvimas 7 dieną. Poveikio nebuvimo rezultatai ne mažiau svarbūs: pats pažeidimas vandens kiekį smegenyse padidino tik nežymiai, o metileno mėlynasis nepašalino kūno masės mažėjimo ar motorinės koordinacijos sutrikimo. Priešuždegiminis poveikis nėra tas pats, kas visapusiška apsauga.

Dviejuose tyrimuose su pelėmis taikyta ta pati schema: 1 mg/kg po vienos valandos, 0.5 mg/kg po šešių valandų, vėliau dozės skirtos kasdien tris dienas. Šie tyrimai papildė žinias apie mechanizmą. Smūgio į smegenų žievę modelyje gydymas sumažino pažeidimo tūrį po 24 valandų, 72 valandų ir 14 dieną, kartu išsaugodamas neuronus ir padidindamas autofagijos žymenų rodiklius (Zhao, 2016). Skysčio perkusijos modelyje jis sumažino neuronų apoptozę, sumažino sutrikusio kraujo ir smegenų barjero pralaidumą ir pagerino neurologinio vertinimo balus per dvi savaites (Shen, 2019). Tačiau Zhao tyrime po 72 valandų vandens kiekis smegenyse nesiskyrė, o Shen tyrime 1 ir 3 dienomis nesiskyrė besisukančio strypo testo rezultatai. Pažeidimo ir ląstelių išlikimo rodikliai keitėsi, tačiau tinimo ir ankstyvieji motoriniai rodikliai ne visada gerėjo kartu.

Skyrimo laiko požiūriu išsiskiria atidėto dozavimo eksperimentas (Watts, 2016). Naudojant tą patį smūgio modelį, pirmoji dozė skirta tik praėjus 24 valandoms po pažeidimo. Iki 2 dienos atidėto skyrimo grupėje pažeidimas sumažėjo panašiai kaip gyvūnams, gydytiems pirmosiomis valandomis, o šis sumažėjimas išliko 7 ir 14 dienomis. Elgesio rodiklių signalas buvo silpnesnis: letenų pastatymo klaidų sumažėjimas atidėto skyrimo grupėje buvo statistiškai nereikšminga tendencija. Viena laboratorija, vienas modelis, vienas 24 valandų langas. Tai tikri įrodymai, kad galimo poveikio laiko langas apima ne vien pirmąsias valandas, tačiau kartu tai ir visi šį teiginį pagrindžiantys įrodymai. Atkreipkite dėmesį į kitur vartojamo žodžio „atidėtas“ spąstus: Rusijos tyrimų serijoje, kurios pavadinime kalbama apie atidėtą neuroprotekciją, dozė buvo skiriama po 30 minučių, o „atidėtas“ reiškė ilgalaikes baigtis, ne vėlyvą gydymo pradžią.

Mažesnis židininio pažeidimo tyrimas su žiurkėmis papildo skyrimo laiko vaizdą iš kitos pusės: tiek dozė, skirta prieš pat pažeidimą, tiek dozė, skirta praėjus 30 minučių po jo, sumažino galūnių funkcijos sutrikimą (Stelmashook, 2019). Išankstinis skyrimas laboratorijoje veikia būtent todėl, kad laboratorija suplanuoja pažeidimą.

Čia svarbu tiksliai atsižvelgti į dozę. Apžvalgose mažos dozės apibūdinamos kaip stimuliuojančios mitochondrijų kvėpavimą, o didelės – kaip jį slopinančios. Tai tas pats dvifazis pobūdis, pastebimas įvairiose metileno mėlynojo farmakologijos srityse. Todėl rezultatų negalima suprasti kaip „daugiau mėlynojo – geresnis atsigavimas“. Kiekvienas tyrimas tikrina vieną kreivės tašką. Dozės ir atsako ryšio paaiškinime ši kreivė nagrinėjama skirtinguose modeliuose, o saugumo ir šalutinio poveikio apžvalgoje aptariama, ką vietoj to sukelia didesnės dozės.

Palyginkite lentelės eilutes: tas pats junginys, trys skirtingos laiko skalės. Prevencija priklauso vidurinei eilutei, neatidėliotinas gydymas – pirmosioms dviem, o vėlyvos baigtys – pirmajai ir trečiajai.

Prevencija, neatidėliotinas gydymas, vėlyvos baigtys

Prevencijos teiginį lengviausia suprasti klaidingai. Išemijos modeliuose gyvūnų, gavusių dozę prieš kraujagyslės okliuziją, rezultatai geresni. Kartais šis rezultatas cituojamas taip, tarsi metileno mėlynasis apsaugotų bet kurias smegenis nuo bet kokio būsimo žalingo poveikio. Jis nieko panašaus neparodo. Jis rodo, kad mitochondrijos, iš anksto parengtos naudoti alternatyvų elektronų kelią, geriau toleruoja suplanuotą kraujotakos nutrūkimą. Galvos traumos niekas neplanuoja.

Daugiausia TBI įrodymų sukaupta apie neatidėliotiną gydymą. Dozavimas pirmosiomis valandomis po smūgio nukreiptas į dar vykstančią antrinio pažeidimo kaskadą: energijos gamybos sutrikimą, oksidacinį stresą, uždegimą, tinimą. Čia gerėjantys pažeidimo ir edemos rodikliai yra tikras gydymo poveikis, tačiau gydomas procesas, o ne atkuriami suplėšyti audiniai.

Vėlyvos baigtys yra trečioji samprata. Elgesio vertinimas praėjus kelioms savaitėms po pažeidimo arba baltymų apykaitos vertinimas praėjus keliems mėnesiams degeneracijos modelyje atsako į klausimą, ar ankstyva apsauga išliko, arba ar pasikeitė lėtų procesų eiga. Mažesnis pažeidimas po 24 valandų, statistiškai nereikšminga elgesio rodiklių tendencija po 24 valandas atidėtos dozės ir geresni labirinto testo rezultatai po kelių mėnesių ilgalaikio dozavimo yra trys skirtingi teiginiai, kuriems reikia skirtingo įrodymų pagrindimo. Šiuo metu tik pirmasis ne kartą pasiekia jam keliamą įrodymų kartelę.

Ko šie įrodymai negali parodyti

Visiems pirmiau aprašytiems rezultatams galioja ta pati riba. Graužikų mitochondrijos reaguoja į metileno mėlynąjį būdais, kurie gali būti būdingi ir žmogaus mitochondrijoms, tačiau žiurkė, gavusi dozę į veną praėjus kelioms minutėms po tiksliai kontroliuoto smūgio, nėra žmogus, atvykęs į skubiosios pagalbos skyrių praėjus kelioms valandoms po kritimo. Anestezija, kontroliuojamas pažeidimo sunkumas, jauni sveiki gyvūnai ir trumpas stebėjimo laikotarpis riboja rezultatų pritaikomumą. Metileno mėlynojo tyrimų sprogimo sukelto pažeidimo atveju apskritai nėra, todėl kariškiams aktualiausias pažeidimo tipas yra tas, apie kurį turima mažiausiai įrodymų.

Taip pat nepateikiama, kaip gyvūnams naudotas dozes perskaičiuoti žmonėms. Tyrimuose su gyvūnais naudojami intraveninis ir intraperitoninis skyrimo būdai bei dozės, pasirinktos eksperimentinei kontrolei užtikrinti, o ne mažmeninėje prekyboje parduodami geriamieji lašai. Nė vienas iš šių tyrimų nenustato žmogui skirtos vartojimo schemos, ir nė viename čia nevertinamas metileno mėlynasis kartu su įprasta galvos traumų gydymo pagalba.

Taigi sąžininga santrauka telpa į vieną pastraipą. Graužikams metileno mėlynasis, skirtas maždaug tuo metu, kai įvyksta trauminis ar išeminis smegenų pažeidimas, išsaugo mitochondrijų energijos gamybą, o po šio išsaugojimo nustatomi mažesni pažeidimai ir geresni atsigavimo vertinimo balai. Viename smūgio tyrime dalis poveikio pažeidimui išliko pirmąją dozę atidėjus 24 valandoms. Ar kuris nors iš šių reiškinių vyksta pažeistose žmogaus smegenyse, netirta, o TBI ir insulto literatūroje tikrinamas skirtingas skyrimo laikas pagal skirtingus vertinimo rodiklius. Kiekvienas, kuris remdamasis šiais įrodymais parduoda tikrumą, prideda sudedamąją dalį, kurios eksperimentuose niekada nebuvo.