Metileno mėlynasis ir skeleto senėjimas: kodėl ląstelių tyrimų rezultatai neprognozavo pelių kaulų pokyčių

Įsivaizduokite junginį, kuris slopina būtent tas ląsteles, kurios ardo kaulą: išbandytas laboratoriniame inde, jis veikia tiksliai taip, kaip tikėtasi. Mažiau daugiabranduolių osteoklastų, aiški priklausomybė nuo dozės, įtikinamas mitochondrijomis paremtas paaiškinimas. Tada tas pats junginys pelėms skiriamas didžiąją jų suaugusio gyvenimo dalį, jų skeletai nuskenuojami trimatėje erdvėje, ir jokio skirtumo nematyti. Seni kaulai atrodo seni, nesvarbu, ar junginys buvo skirtas, ar ne.

Toks yra sąžiningas vieno 2024 metų tyrimo vaizdas. Jį verta tiksliai suprasti, nes jis atsiduria ties ta riba, kur neatlaiko dauguma teiginių apie papildų poveikį kaulams. Tai Poudel ir kolegų straipsnis, paskelbtas žurnale „Aging“ 2024 metų kovą. Jis yra atvirosios prieigos, todėl kiekvieną toliau pateiktą matavimą galima patikrinti pirminiame šaltinyje. Pagrindinė jo išvada – poveikio nenustatyta. Tokie rezultatai nėra nesėkmė. Tai atsakymai, ir šis tyrimas gerai atsako į siaurą klausimą: ar ilgalaikis sisteminis antioksidacinis poveikis, skiriant metileno mėlynąjį arba mitochinoną, padeda išsaugoti senstantį pelės skeletą? Ne.

Kaip kaulų senėjimas atrodo skaičiais

Kaulų nykimas su amžiumi nėra vienas reiškinys, todėl tyrime nebuvo matuojamas tik vienas rodiklis. Naudodami mikrokompiuterinę tomografiją, tyrėjai skenavo tris skeleto vietas: žievinį kaulą šlaunikaulio diafizės viduryje (tankiąją kaulo kūno dalį), trabekulinį kaulą šlaunikaulio distalinėje metafizėje (akytąjį tinklą šalia sąnario) ir trabekulinį kaulą penktajame juosmens slankstelyje. Kiekvienoje vietoje jie registravo standartinius mikroarchitektūros rodiklius. BV/TV yra tūrio dalis, kurią užima kaulas, o ne kaulų čiulpų ertmės. BMD yra mineralinis tankis. Tb.Th, Tb.N ir Tb.Sp apibūdina trabekulių storį, skaičių ir tarpus tarp jų. Žievinio sluoksnio storis ir skerspjūvio plotai apibūdina kaulo kūną.

Įsivaizduokite trabekulinį kaulą kaip atraminį karkasą sandėlio viduje. Senstant kai kurios atramos visiškai pašalinamos, o likusios suplonėja, todėl mažėja konstrukcijos užimama erdvės dalis, likusios atramos nutolsta viena nuo kitos, o visas karkasas atlaiko mažesnę apkrovą. Žievinis kaulas – tai pati sandėlio siena, kuri plonėja. Skeletą saugantis poveikis turėtų atsispindėti šiuose skaičiuose. Būtent taip jis buvo tikrinamas šiame tyrime.

Kas vyko laboratoriniame inde

Ląstelių tyrimams naudoti kaulų čiulpai, paimti iš 6–7 mėnesių amžiaus UM-HET3 pelių šlaunikaulių ir blauzdikaulių. Tai genetiškai įvairi pelių linija, išvesta senėjimo tyrimams. Gauti keturi rezultatai, ir jie rodo skirtingas kryptis, todėl kiekvieną reikia aptarti atskirai.

Pirma, mezenchiminės kamieninės ląstelės, tarp kurių yra būsimų kaulą formuojančių ląstelių, išliko gyvybingos 48 valandas veikiant metileno mėlynojo ir mitochinono koncentracijomis nuo 0.125 iki 0.5 mikromolio litre. Nei toksiškumo, nei pagerėjimo. Antra, kai šios kamieninės ląstelės osteogeninėje terpėje buvo skatinamos virsti osteoblastais ir 18 dieną nudažytos šarminei fosfatazei nustatyti, nė vienas junginys nepakeitė rezultato esant jokiai tirtai koncentracijai. Kaulą formuojančios ląstelės inde nereagavo.

Trečia, kaulą ardančios ląstelės reagavo. Kaulų čiulpų pirmtakinės ląstelės, stimuliuotos M-CSF ir RANKL – įprastu osteoklastų susidarymo deriniu, – didėjant koncentracijai suformavo mažiau TRAP teigiamų daugiabranduolių ląstelių. Aiškus sumažėjimas pasireiškė viršijus 0.25 mikromolio litre, praktiškai esant didžiausiai tirtai koncentracijai – 0.5. Būtent šis rezultatas paskatina daugybę optimistinių apibendrinimų, ir pagal savo ribas jis yra tikras: tiesioginis, nuolatinis poveikis kultūroje slopino osteoklastų susidarymą priklausomai nuo dozės.

Ketvirta, brandžiuose osteoblastuose, kurie buvo veikiami 48 valandas ir tirti mitochondrijų streso testu, nė vienas junginys reikšmingai nepakeitė bazinio ar maksimalaus deguonies suvartojimo. Esant 0.5 mikromolio litre koncentracijai, abu junginiai, regis, šiek tiek mažino kvėpavimą, tačiau pokytis nebuvo statistiškai reikšmingas. Taigi laboratoriniame inde nenustatyta mitochondrijų funkcijos pagerėjimo kaulą formuojančiose ląstelėse, kuris papildytų osteoklastus slopinantį poveikį. Siūlomas mechanizmas – geresnė energijos apykaita per mitochondrijų elektronų pernašos grandinę – nesukėlė išmatuojamo kvėpavimo pagerėjimo ten, kur tyrėjai jo ieškojo.

Kas vyko pelėms

Toliau atlikti du labai skirtingo masto eksperimentai su gyvūnais.

Mažesniajame naudotos inbredinės C57BL/6J patelės – biomedicininiuose tyrimuose itin dažnai naudojama pelių linija. Nuo 18 mėnesių amžiaus, kuris pelei apytikriai atitinka vėlyvą vidutinį amžių, pusė jų 6 arba 12 mėnesių gėrė vandenį su 250 mikromolių litre metileno mėlynojo, kol sulaukė 24 arba 30 mėnesių. Junginio negavusios 18 mėnesių patelės suteikė pradinius palyginimo duomenis, o 5 mėnesių patelės parodė, kaip atrodo jaunas kaulas. Senėjimas vyko taip, kaip ir vyksta senėjimas. L5 slankstelyje kaulo tūrio dalis sumažėjo apie 35 procentus, mineralinis tankis – apie 18 procentų, o trabekulių skaičius sumažėjo maždaug perpus, nepriklausomai nuo to, ar junginys buvo skirtas. Žievinio sluoksnio storis nuo 18 iki 24 mėnesių sumažėjo maždaug 10 procentų, o iki 30 mėnesių – maždaug 30 procentų. Metileno mėlynasis nepakeitė nė vienos iš šių kreivių.

Didesnis eksperimentas vykdytas pagal JAV Nacionalinio senėjimo instituto intervencijų bandymų programą, kurioje galimi junginiai tikrinami abiejų lyčių UM-HET3 pelėms trijose tyrimų vietose. Metileno mėlynasis, kurio koncentracija pašare buvo 28 milijoninės dalys, ir mitochinonas, kurio koncentracija buvo 100 milijoninių dalių, pradėti skirti ankstyvame suaugusių pelių amžiuje ir skirti maždaug iki 22–24 mėnesių amžiaus. Tos pačios trys skeleto vietos tirtos mikrokompiuterine tomografija. Paskelbtoje lentelėje kiekvienas rodiklis pateikiamas pagal lytį ir skirtą junginį, taikant statistines korekcijas, o poveikio skiltyje visur nurodoma tas pats: jokio reikšmingo poveikio, jokios junginio ir lyties sąveikos, nė vienoje vietoje. Žievinis ar trabekulinis kaulas, šlaunikaulis ar stuburas, patinas ar patelė, metileno mėlynasis ar mitochinonas – skeletas senėjo įprastu tempu.

Abiejų tyrimo dalių rezultatų palyginimo lentelė

Šia lentele remiasi visas straipsnis. Kiekvienoje eilutėje sugretinama, ką apie tą patį biologinį procesą parodė ląstelių ir gyvūnų tyrimai, naudojant paties tyrimo matavimus.

Skaitant eilutę po eilutės, paradoksas išnyksta. Reagavo tik vienas iš keturių ląstelinių procesų, ir tik arti viršutinės tirtų koncentracijų ribos, esant nuolatiniam tiesioginiam poveikiui. Visa kita laboratoriniame inde jau buvo be pokyčių. Tuomet gyvūnų tyrimo rezultatas atrodo ne tiek prieštaravimas, kiek patvirtinimas: trys poveikio nebuvimo rezultatai ir vienas sąlyginis poveikis kultūroje gyvūnų tyrime virto visuotiniu poveikio nebuvimu.

Kaulų struktūra nėra gyvenimo trukmė

Vienas painiojimas vertas atskiro skyriaus, nes metileno mėlynojo poveikis gyvenimo trukmei išties yra tirtas, o tuos duomenis lengva klaidingai palaikyti duomenimis apie kaulus. Ankstesnėje intervencijų bandymų programos kohortoje metileno mėlynasis, skiriamas ta pačia doze su pašaru, maždaug 6 procentais padidino UM-HET3 patelių gyvenimo trukmės 90-ąjį procentilį. Tai buvo poveikis išgyvenamumui vėlyvame amžiuje, nepakeitęs gyvenimo trukmės medianos ir neturėjęs poveikio patinams. Mitochinonas neturėjo poveikio nė vienos lyties gyvenimo trukmei. Šie išgyvenamumo skaičiai pateikti programos paskelbtuose ilgaamžiškumo duomenyse, o ne straipsnyje apie kaulus.

Straipsnio apie kaulus indėlis – aiškiai atskirti šias dvi duomenų sritis. Junginys gali pakeisti vienos lyties išgyvenamumą vėlyvame amžiuje, neišsaugodamas nė vieno matuoto skeleto rodiklio. Vertinant išgyvenamumą skaičiuojamos mirtys dėl visų priežasčių; mikrokompiuterinė tomografija skaičiuoja atramas slankstelyje. Nėra taisyklės, kad intervencija, norėdama pailginti gyvenimą, būtinai turi veikti per kaulus. Šis tyrimas yra tiesioginis įrodymas, kad metileno mėlynojo poveikis patelėms vėlyvame amžiuje pasireiškė kitu keliu. Kas gyvenimo trukmės rezultatą pateikia kaip metileno mėlynojo naudos sergant osteoporoze pagrindimą, naudoja duomenis ne iš tos sąskaitos. Bendras principas, kaip šių duomenų sričių nepainioti, aptariamas straipsnyje kaip skaityti metileno mėlynojo tyrimus.

Kodėl laboratorinio indo rezultatai neprognozavo pelių rezultatų

Duomenis atitinka penki paaiškinimai, ir jie vienas kito neatmeta.

Pirmasis – ekspozicija. Ląstelės kultūroje buvo nuolat veikiamos žinomomis koncentracijomis. Pelės mėnesius ėdė pašarą su junginiais, tačiau tyrime nematuota nei jų koncentracija kaulų čiulpuose, nei jokie oksidacinės pažaidos kauluose žymenys. Koncentracija, kuri tiesiogiai veikiant slopina osteoklastus, kaulų čiulpų pirmtakinių ląstelių gali niekada nepasiekti. Tyrime in vivo išbandyta po vieną kiekvieno junginio dozę, todėl gyvūnų atsako priklausomybė nuo dozės lieka nežinoma.

Antrasis – chemija. Reaktyviosios deguonies formos ląstelės viduje nesudaro vieno gerai susimaišiusio telkinio. Jos veikia mažuose skyriuose ir trumpais laikotarpiais, o mitochondrijų, citozolio ir membranų oksidacijos bei redukcijos sistemos veikia iš dalies nepriklausomai. Mitochinonas sukurtas taip, kad kauptųsi mitochondrijose, tačiau osteoklastų susidarymą skatinantys oksidaciniai signalai gali kilti kitur. Sumažinus vieno telkinio aktyvumą, nebūtinai pakartojamas poveikis, kurį sukelia nuolatinis visos ląstelės veikimas junginiu.

Trečiasis – procesų sąsaja. Gyvame kaule rezorbcija ir formavimasis susiję: osteoklastai ir gretimos ląstelės siunčia signalus, kurie į ką tik rezorbuotą vietą pritraukia kaulą formuojančias ląsteles. Osteoklastų susidarymo slopinimas neprideda lygiaverčio kaulo kiekio, nes kartu gali panaikinti signalus, kurie kviečia kaulo „statytojus“. Indas, kuriame yra tik pirmtakinės ląstelės, negali parodyti šio grįžtamojo ryšio. Skeletas jo negali paslėpti.

Ketvirtasis – apkrova. Osteocitai jaučia mechaninę deformaciją ir nustato viso kaulo persitvarkymo pusiausvyrą. Gyvūnams senstant ir mažiau judant, mechaninis signalas silpnėja, o kaulas nyksta nepaisant nedidelio farmakologinio poveikio vieno tipo ląstelėms. Patys autoriai fizinį aktyvumą ir kaulo formavimąsi skatinančią apkrovą įvardija kaip labiau tikėtiną poveikio svertą. Tai mandagus būdas pasakyti, kad skeletas labiau klauso fizikos nei oksidacijos ir redukcijos chemijos.

Penktasis – pradžios laikas, tačiau su išlyga. C57BL/6J eksperimente junginys pradėtas skirti sulaukus 18 mėnesių, kai reikšminga struktūrinė kaulo dalis jau buvo prarasta. Jokia rezorbciją slopinanti priemonė negali atkurti prakiurusių ir pašalintų trabekulių be atitinkamo kaulo formavimosi stimulo. Tačiau pradžios laikas negali paaiškinti visko, nes intervencijų bandymų programoje junginiai pradėti skirti ankstyvame suaugusių pelių amžiuje ir vis tiek nieko nepakeitė. Vėlyva pradžia paaiškina dalį vieno eksperimento. Kito ji nepaaiškina visai.

Ką tai reiškia teiginiams apie metileno mėlynąjį ir osteoporozę

Skaitytojui, vertinančiam metileno mėlynąjį kaulų sveikatos ar skeleto senėjimo požiūriu, praktinė išvada trumpa. Geriausi turimi ilgalaikių tyrimų su pelėmis duomenys nerodo naudos skeletui ilgai skiriant metileno mėlynąjį ar mitochinoną, nors kultūroje nustatytas tikras osteoklastus slopinantis poveikis. Gyvenimo trukmės literatūroje metileno mėlynajam priskiriamas nedidelis poveikis vėlyvame amžiuje tik patelėms, o šis tyrimas rodo, kad jis pasireiškė ne per kaulus. Nė viena duomenų sritis nepagrindžia vartojimo žmonėms dėl osteoporozės, o duomenų apie žmonių kaulus čia apskritai nėra. Dozavimo ir produkto saugos žmonėms klausimai priklauso temai metileno mėlynojo sauga ir šalutinis poveikis, o ne šiam pelių skeleto tyrimui.

Gilesnė pamoka susijusi su įrodymų tvarka. Ląstelių tyrimo rezultatas nusako, ką junginys gali padaryti vieno tipo ląstelėms kontroliuojamo poveikio sąlygomis. Kaulų tyrimo rezultatas nusako, ką mėnesius trunkantis sisteminis poveikis padaro organui, kuriame mechaninė kontrolė susieja dviejų tipų ląsteles. Pirmuoju atveju gimsta hipotezės. Antruoju ši hipotezė apie skeleto senėjimą ir šiuos du antioksidantus buvo atmesta.