Straipsnis
Metileno mėlynasis ir regėjimas: ką rodo tinklainės tyrimai ir kur jų ribos
Skaitytojas aptinka tyrimą, kuriame metileno mėlynasis apsaugojo tinklainę, ir užduoda natūralų klausimą: ar jį reikėtų lašinti į akį? Metileno mėlynojo ir regėjimo tyrimai į šį klausimą neatsako, nes nė viename iš pagrindinių tyrimų toks naudojimas netirtas. Viename dažiklis kartu su toksinu suleistas į pelių stiklakūnį. Kitame jo pridėta į terpę, kurioje buvo izoliuotos ląstelės. Trečiame jo įpilta į pelių mutančių geriamąjį vandenį. Kiekvienas rezultatas taikytinas tik konkrečiam vartojimo būdui ir modeliui.
Šiame straipsnyje aptariami trys ikiklinikiniai tyrimai, du tinklainės ląstelių tipai ir riba tarp apsaugos laboratorijoje bei klinikinio akių gydymo. Visuose tyrimuose matoma ta pati tendencija: kontroliuojamomis sąlygomis metileno mėlynasis gali keisti mitochondrijų stresą tinklainės ląstelėse, tačiau šis rezultatas nepateisina mažmeninėje prekyboje parduodamų tirpalų naudojimo akyse.
Du ląstelių tipai, dvi skirtingos ligos
Tinklainė sudaryta iš sluoksnių, ir svarbu, kuris sluoksnis tiriamas. Šviesa pirmiausia pasiekia išorinėje tinklainės dalyje esančius fotoreceptorius. Jų signalai per tarpinius neuronus perduodami vidinėje tinklainės dalyje esančioms ganglioninėms ląstelėms, kurių aksonai iš akies išeina regos nervu. Toliau pateiktoje schemoje sluoksniai įvardyti iš eilės.
Tinklainės ganglioninės ląstelės yra tos ląstelės, kurioms gresia pažeidimas sergant glaukoma ir optine neuropatija. Kai paieškose minimi metileno mėlynasis ir glaukoma, paprastai kalbama apie šį vidinį sluoksnį ir jo aksonus. Fotoreceptoriams gresia pažeidimas vykstant išorinės tinklainės degeneracijai. Jų energijos poreikis yra didžiausias tinklainėje, o ląstelinis kvėpavimas vyksta beveik ties pajėgumo riba, todėl sutrikus mitochondrijų I komplekso veiklai lieka mažai atsarginių pajėgumų. Vieno ląstelių tipo tyrimo rezultatas negali būti taikomas kitam, ir trijuose toliau aptariamuose tyrimuose šie tipai atskiriami. Bendras gebėjimas atskirti modelius nuo išvadų paaiškintas straipsnyje kaip skaityti metileno mėlynojo tyrimus.
Ganglioninės ląstelės gyvos pelės akyje
Ankstyviausiame iš šių trijų tyrimų mokslininkai modeliavo optinę neuropatiją mikroinjekcija suleisdami rotenono į vienos pelės akies stiklakūnį, o kitą akį naudojo kaip kontrolę, kuriai suleistas tik tirpiklis. Rotenonas blokuoja mitochondrijų I kompleksą – pradinę grandį, perduodančią elektronus iš NADH toliau. I komplekso veiklos sutrikimas taip pat sieja šį modelį su Leberio paveldimąja optine neuropatija – ganglioninių ląstelių ir regos nervo liga.
Po dvidešimt keturių valandų rotenono gavusių akių ganglioninių ląstelių sluoksnis buvo plonesnis ir jame buvo mažiau ląstelių nei kontrolinėse akyse. Kai metileno mėlynasis buvo suleistas kartu su rotenonu, šio pažeidimo buvo išvengta priklausomai nuo dozės: didžiausia tirta dozė (0.07 mg/kg, gerokai mažesnė už pelių LD50) išsaugojo ir sluoksnio storį, ir ląstelių skaičių. Lygiagrečiai atlikti smegenų homogenatų tyrimai parodė du poveikius: metileno mėlynasis panaikino rotenono sukeltą oksidacinį stresą ir deguonies suvartojimo sumažėjimą. Autoriai pasiūlė ekscitotoksinį mechanizmą: rotenonas pažeidžia signalus moduliuojančias amakrinines ląsteles, ganglioninės ląstelės pernelyg intensyviai generuoja impulsus, o antioksidacinis poveikis nutraukia dėl to kylantį pažeidimą. Siūlomi cheminiai šios apsaugos pagrindai išsamiai aptariami straipsnyje apie metileno mėlynojo veikimo mitochondrijose mechanizmus.
Šis rezultatas turi tris apribojimus. Dažiklis buvo suleistas kartu su toksinu tiesiai į akį – tai medžiagos patekimo būdas, o ne gydymo schema. Stebėjimo laikotarpis truko 24 valandas. Be to, citochromo oksidazės rodikliai padidėjo abiejose pažeidimą patyrusiose grupėse, ir autoriai tai vertino kaip pernelyg didelį aktyvumą, o ne kaip atkurto kvėpavimo gyvoje tinklainėje įrodymą.
Lėkštelėje izoliuotos ganglioninės ląstelės
Antrajame tyrime pačios akies nebuvo. Tyrėjai iš jaunų žiurkių išskyrė pirmines tinklainės ganglionines ląsteles ir paveikė jas rotenonu, apoptozę sukeliančiu staurosporinu arba 72 valandas laikė mažo deguonies kiekio sąlygomis, o tada išgyvenamumą vertino dažydami gyvas ir negyvas ląsteles. Kultūros terpėje esantis 1 ir 10 mikromolinės koncentracijos metileno mėlynasis pagerino išgyvenamumą esant kiekvienam žalingam poveikiui – maždaug nuo 1.5 iki 1.9 karto, priklausomai nuo sąlygų. Papildomas bandymas parodė, kad metileno mėlynasis išsaugojo citochromo c oksidazės aktyvumą veikiant vandenilio peroksidu.
Tai izoliuotų ląstelių farmakologija. Junginys ląsteles pasiekė difuzijos būdu per kultūros terpę, kurioje jo koncentracija buvo nustatyta, o jo kelyje nebuvo ragenos, ašarų plėvelės, lęšiuko, stiklakūnio, kraujotakos ar imuninės sistemos. Šis paprastumas ir yra modelio esmė: jis rodo, kad pačias ganglionines ląsteles galima apsaugoti, kai junginys jas pasiekia. Jis nieko nepasako apie tai, ar ant ragenos paviršiaus užlašintas lašas galėtų užtikrinti kokią nors apibrėžtą koncentraciją vidinėje tinklainės dalyje. Didesnių nei 10 mikromolinių koncentracijų vengta dėl toksiškumo toms pačioms ląstelėms – tai priminimas, kad lėkštelėje dozės ir atsako ryšys gali veikti abiem kryptimis.
Pelių mutančių ir ląstelių linijos fotoreceptoriai
Trečiasis tyrimas skirtas išorinei tinklainės daliai. Mokslininkai naudojo Harlequin peles, kurioms būdingas apoptozę sukeliančio faktoriaus trūkumas, dėl kurio I kompleksas lieka nevisiškai surinktas, ir 11 mėnesių amžiaus pelėms tyrė fotoreceptorių struktūrą, išorinių segmentų žymenis bei mitochondrijų vientisumą. Po nujunkymo metileno mėlynasis buvo skiriamas sistemiškai su geriamuoju vandeniu, maždaug 10 mg/kg per dieną. Jo gavusių mutančių tinklainė išliko storesnė, jose išliko daugiau rodopsino ir opsino žymenų, o mitochondrijų struktūra buvo geresnės būklės nei jo negavusių mutančių.
Papildomame ląstelių tyrime naudotos 661W ląstelės – į pelių fotoreceptorius panaši nemirtinga ląstelių linija, kuri 24 valandas buvo veikiama rotenonu su metileno mėlynuoju arba be jo. Esant 30 mikromolinei koncentracijai išgyvenamumas pagerėjo, o mažesnės koncentracijos normalizavo NADH ir NAD+ santykį bei sumažino oksidacinį stresą. Ypač svarbu tai, ko metileno mėlynasis nepadarė: jis neatkūrė ATP kiekio. Apsauga buvo susijusi su sumažėjusiu redokso stresu ir slopinamais streso keliais, įskaitant mitochondrijų atsaką į nesusilanksčiusius baltymus ir mitofagijos žymenis, o ne su atkurtu energijos tiekimu.
Šis skirtumas svarbus vertinant teiginius apie metileno mėlynąjį ir tinklainę. Junginys gali išlaikyti stresą patiriantį fotoreceptorių gyvą, nepašalindamas jo energijos trūkumo, todėl bet kokia terapinė interpretacija apsiriboja redokso stresu, o ne visapusišku atjauninimu.
Trijų tyrimų palyginimas
Toliau pateiktame palyginime kiekvienas tyrimas apibūdinamas pagal modelį ir vartojimo būdą, nes būtent šie du stulpeliai lemia, kokias išvadas gali pagrįsti rezultatas.
| Tyrimas | Modelis | Metileno mėlynojo vartojimo būdas | Kas išsaugota |
|---|---|---|---|
| Zhang ir kolegos, pelių optinė neuropatija | Rotenono pažeista gyvos pelės tinklainė | Suleistas į stiklakūnį kartu su toksinu | Ganglioninių ląstelių sluoksnio storis ir ląstelių skaičius po 24 valandų |
| Daudt ir kolegos, pirminės žiurkių ganglioninės ląstelės | Izoliuotos ganglioninės ląstelės kultūroje | Ištirpintas kultūros terpėje, nuo 1 iki 10 mikromolinės koncentracijos | Ląstelių išgyvenamumas veikiant rotenonu, staurosporinu ir hipoksija |
| Mekala ir kolegos, Harlequin pelės ir 661W ląstelės | Genetinis I komplekso defektas ir į fotoreceptorius panašios ląstelės | Geriamasis vanduo, 10 mg/kg per dieną; 30 mikromolinė koncentracija ląstelių terpėje | Fotoreceptorių struktūra ir mitochondrijų vientisumas, neatkuriant ATP |
Kiekviena eilutė aprašo ikiklinikinį tyrimą. Nė viename nedalyvavo pacientai, nebuvo vertinamas regėjimas ar tiriama akims skirta farmacinė forma.
Kodėl tai nėra glaukomos gydymas
Gydant glaukomą mažinamas akispūdis. Neuroprotekcija siekiama ko kito: išlaikyti ganglionines ląsteles ir jų aksonus gyvus streso sąlygomis. Aukščiau aptarti tyrimai priklauso antrajai, o ne pirmajai krypčiai. Nė viename iš jų akispūdis nebuvo mažinamas ir nė viename metileno mėlynasis nebuvo lyginamas su akispūdį mažinančiu gydymu. Todėl nusistovėję glaukomos gydymo ir akispūdžio kontrolės metodai lieka atskiras klausimas nuo redokso neuroprotekcijos, o ląstelių išgyvenamumo rezultato negalima laikyti išsaugotu regėjimu.
Vartojimo būdų skirtumai dar labiau tai pabrėžia. Kartu atliekama injekcija į stiklakūnį žinomą kiekį patalpina šalia tinklainės pažeidimo metu. Skyrimas su geriamuoju vandeniu veikia visą gyvūną mėnesius, o koncentracija tinklainėje lieka nežinoma. Kultūros terpė tiesiogiai veikia ląsteles be apsauginių barjerų. Nė vienas iš šių būdų neleidžia numatyti, kokia vietiškai pavartotos dozės dalis prasiskverbtų pro rageną, nebūtų pašalinta su ašaromis, pereitų lęšiuką bei stiklakūnį ir pasiektų vieną ar kitą tinklainės sluoksnį naudinga koncentracija. Ši medžiagos patekimo problema yra platesnio klausimo apie metileno mėlynojo vartojimo būdus ir pasiskirstymą dalis: kiekvienam vartojimo būdui reikia atskirų koncentracijos matavimų.
Audinių skirtumai sudaro antrą kliūtį. Priekinę akies dalį pasiekęs dažiklis dar nėra pasiekęs užpakalinės dalies, o vienam sluoksniui naudinga koncentracija gali pažeisti kitą. Mažmeninėje prekyboje parduodami tirpalai nėra gaminami, sterilizuojami, buferuojami ar konservuojami kaip akių preparatai, o grynumas, pH, osmoliškumas ir pagalbinės medžiagos yra svarbūs tiek ragenos, tiek akies vidaus poveikiui. Nė vienas iš šių tinklainės tyrimų rezultatų nepagrindžia tokių tirpalų naudojimo akies viduje ar ant jos paviršiaus. Preparatų standartų klausimai priklauso metileno mėlynojo saugos ir tvarkymo temai.
Kur baigiasi įrodymai
Vertinami kartu, šie trys straipsniai pagrindžia siaurą teiginį: kontroliuojamomis sąlygomis metileno mėlynasis gali sumažinti mitochondrijų redokso stresą tinklainės neuronuose ir išsaugoti jų struktūrą. Teiginys galioja tik tomis sąlygomis. Toksino poveikio ir genetinio I komplekso defekto modeliai nėra glaukoma, drūzos ar diabetinė liga. Trumpi stebėjimo laikotarpiai ir struktūrinės vertinamosios baigtys nėra ilgalaikis regėjimo išsaugojimas. O apsauginė koncentracija viename skyriuje nėra dozė kitam.
Tvirtesniam pagrindimui reikėtų atskirų įrodymų: apibrėžtos ekspozicijos tinklainėje po kliniškai tinkamo vartojimo būdo, funkcinių regėjimo vertinimo baigčių gyvūnams, nuo akispūdžio nepriklausomos naudos glaukomai tinkamame modelyje ir galiausiai saugumo bei veiksmingumo duomenų žmonėms. Kol jų nėra, metileno mėlynojo ir regėjimo ryšys lieka aiškias ribas turinčia tyrimų hipoteze: tikėtinas farmakologinis poveikis tinklainės mitochondrijoms, parodytas tik ląstelėse ir gyvūnuose, tačiau šie tyrimai nesuteikia pagrindo pereiti prie akių gydymo.