Metileno mėlynasis ir ląstelių senescencija: fibroblastų tyrimų rodikliai

Dažnas klaidingas supratimas atrodo taip. Straipsnyje pranešama, kad dėl metileno mėlynojo kultivuojamų fibroblastų populiacija padvigubėjo daugiau nei 20 papildomų kartų, todėl skaitytojas daro išvadą, kad jis pašalina senescentines ląsteles arba panašiu mastu pailgina žmogaus gyvenimą. Tokia išvada atrodo natūrali. Tačiau ji klaidinga dviem atskirais aspektais.

Esminė problema yra sąvokinė, o ne skaitinė. Populiacijos padvigubėjimai, senescencijos žymenys ir telomerų matavimai atsako į skirtingus klausimus. Metileno mėlynojo tyrimus su fibroblastais geriausia suprasti kaip vieno tipo ląstelių senescencijos pradžios atitolinimo tyrimus kultūros lėkštelėje, kuriuos papildo mitochondrijų rodiklių matavimai. Tai skiriasi nuo selektyvaus jau senescentinių ląstelių pašalinimo ir, savo ruožtu, nuo organizmo senėjimo. Platesnis šio skirtumo kontekstas apima tai, kaip mitochondrijų elektronų pernaša lemia ląstelės energijos apykaitą, ir tai, kaip interpretuoti teiginius apie metileno mėlynojo tyrimus.

Populiacijos padvigubėjimai skaičiuoja istoriją, o ne jaunystę

Dauguma svarbiausių rezultatų gauti tiriant IMR90 ląsteles – normalių žmogaus vaisiaus plaučių fibroblastų liniją, turinčią ribotą replikacinį pajėgumą. Ankstyvajame metileno mėlynojo ir IMR90 fibroblastų replikacinės gyvavimo trukmės tyrime kultūros buvo persėjamos pagal nustatytą grafiką, o bendras populiacijos padvigubėjimų skaičius registruojamas tol, kol kultūra nustojo dalytis. Nanomolinių koncentracijų, daugiausia 100 nM, poveikis leido kultūroms iki dalijimosi sustojimo sukaupti daugiau nei 20 papildomų padvigubėjimų.

Populiacijos padvigubėjimas yra apskaitos vienetas. Jis parodo, kiek kartų populiacija apytikriai padvigubėjo. Jis tiesiogiai neparodo, ar atskira ląstelė yra senescentinė, ramybės būsenos, diferencijuota ar negyva. Kultūra gali sukaupti daugiau padvigubėjimų, nes ląstelės ilgiau išlaiko gebėjimą dalytis, nes dėl streso mažiau ląstelių anksti nustoja dalytis arba nes sąlygos palankios proliferuojančios subpopuliacijos atrankai. Vien skaičius neleidžia atskirti šių galimybių.

Todėl padvigubėjimų skaičiavimas derinamas su žymenų tyrimais. Skaičius parodo, kiek laiko truko proliferacija. Žymenys parodo, į kokią būseną perėjo nustojusios dalytis ar išlikusios ląstelės.

Vertinamų rodiklių vadovas: ką parodo kiekvienas žymuo

Senescencija kultūroje yra fenotipas, nustatomas pagal kelis nepriklausomus matavimus. Nė vienas dažymas ar baltymas atskirai jos neįrodo.

Augimo sustojimas ir DNR sintezės sumažėjimas. Ilgalaikis dalijimosi sustojimas tikrinamas pagal sumažėjusį BrdU arba EdU įsijungimą, suplokštėjusią morfologiją ir negebėjimą vėl augti po persėjimo. Tai leidžia atskirti senescentinį dalijimosi sustojimą nuo laikinos ramybės būsenos.

Su senescencija susijusi beta galaktozidazė. SA-beta-gal dažymas parodo lizosomų aktyvumą esant maždaug pH 6.0. Senescentinių fibroblastų dažymas dažnai būna teigiamas, nes didėja lizosomų masė. Šis žymuo nėra specifinis, todėl vertinamas kartu su proliferacijos ir molekuliniais žymenimis.

p16 ir p21 signaliniai keliai. p16 veikia per CDK4 ir CDK6 bei RB kelią. p21 dažnai indukuojamas per p53. Didėjantys jų kiekiai yra dalijimosi sustojimą pagrindžiantis požymis, tačiau nė vienas iš šių baltymų nėra būdingas tik senescencijai.

Sekrecinė būsena. Su senescencija susijęs sekrecinis fenotipas, arba SASP, reiškia pakitusį citokinų, chemokinų, augimo faktorių ir proteazių išskyrimą. SASP veiksnių RNR ar baltymų tyrimai apibūdina, kaip ląstelės perduoda signalus kaimyninėms ląstelėms. Jie tiesiogiai nematuoja replikacinio pajėgumo.

Oksidantai ir mitochondrijų rodikliai. Metileno mėlynojo tyrimai prideda mitochondrijų matavimų lygmenį: IV komplekso kiekį ir aktyvumą, deguonies suvartojimą, hemo sintezę, membranų masę, membranos potencialą, ATP ir oksidantų signalus. Jie apibūdina metabolinę būseną, lydinčią vėlesnį dalijimosi sustojimą. Patys savaime jie neapibrėžia senescencijos, tačiau leidžia patikrinti siūlomą mechanizmą. Oksidacijos ir redukcijos ciklo modelis, kuriame NAD(P)H redukuoja metileno mėlynąjį, o citochromas c jį vėl oksiduoja, išdėstytas tame pačiame IMR90 tyrime, susiejančiame oksidacijos ir redukcijos ciklą su mažesne oksidantų gamyba. Susiję dozavimo ir pasiskirstymo principai aptariami nagrinėjant metileno mėlynojo farmakologiją ir jo ekspoziciją audiniuose.

Telomerų trumpėjimo greitis. Tinkamas vienetas yra per vieną padvigubėjimą prarastų bazių porų skaičius, matuojamas kelias savaites, o ne ilgis vienu laiko momentu. Lėtesnis trumpėjimas reiškia mažesnį sutrumpėjimą per replikaciją. Tai nereiškia ilgėjimo, o stresas gali sustabdyti IMR90 ląstelių dalijimąsi net ir esant nedideliems telomerų pokyčiams.

Trijų fibroblastų tyrimų schemų palyginimas

Toliau pateiktas palyginimas yra originali šio puslapio medžiaga. Jame vienoje vietoje pateikiamas ląstelių tipas, ekspozicija, matavimai ir ribotumai.

Tyrimas	Ląstelės ir ekspozicija	Kas buvo matuota	Ko tyrimas negali parodyti
Atamna ir kt., FASEB J 2008	Normalūs IMR90 fibroblastai, ilgalaikė nanomolinių metileno mėlynojo koncentracijų ekspozicija, 100 nM kaip standartinė sąlyga	Bendras padvigubėjimų skaičius, IV komplekso kiekis, nuo 37 iki 70 procentų padidėjęs deguonies suvartojimas, hemo sintezė, apsauga nuo vandenilio peroksido arba kadmio sukeltos priešlaikinės senescencijos, 2 fazės fermentai HepG2 ląstelėse	Senescentinių ląstelių pašalinimas netirtas. Nevertinta gyvūnų ar žmonių ilgaamžiškumo baigtis. Replikacinė gyvavimo trukmė čia reiškia padvigubėjimus kultūros lėkštelėje.
Atamna ir kt., Redox Biology 2015, aprašytas tolesniame AMPK ir IV komplekso biogenezės mechanizmų tyrime	IMR90 fibroblastai, daugiausia 100 nM metileno mėlynojo, palyginimui naudojant AICAR kaip ilgalaikį AMPK aktyvatorių	NAD ir NADH santykio kitimas laikui bėgant, trumpalaikis AMPK fosforilinimas, PGC-1alpha ir SURF1 indukcija, daugiau nei 100 procentų padidėjęs IV komplekso aktyvumas, 28 procentais mažesnis oksidantų kiekis, lėtesnis telomerų trumpėjimas, maždaug 18 papildomų padvigubėjimų, palyginti su maždaug 2 naudojant AICAR, poveikio ląstelės ciklui nenustatyta	AICAR dozė skiriasi maždaug 1000 kartų, skiriasi ir specifiškumas, todėl lyginamas aktyvacijos pobūdis, o ne vienodo poveikio stiprumo sąlygos. Telomerų rezultatas taikomas kelias savaites besidalijančioms kultūroms.
Xiong ir kt., Aging Cell 2016, pateiktas progerijos fibroblastų tyrime apie mitochondrijų ir branduolio pakitimų korekciją	Pirminiai Hutchinsono–Gilfordo progerijos odos fibroblastai ir atitinkami normalūs kontroliniai fibroblastai, daugiausia 100 nM nuo 5 iki 12 savaičių	Mitochondrijų forma fluorescencinės ir elektroninės mikroskopijos metodais, judrumas stebint gyvas ląsteles, superoksidas, membranos potencialas, ATP, PGC-1alpha, proliferacijos ir senescencijos žymenys, taip pat branduolio išsigaubimai, progerino lokalizacija, heterochromatinas ir genų raiška	Konkrečiai ligai būdingas priešlaikinio senėjimo modelis, o ne normalus senėjimas. Morfologijos ir žymenų pokyčių korekcija nėra senescentinių ląstelių pašalinimas. Nevertintas veiksmingumas gyvūnams ar klinikinė baigtis.
Xue ir kt., Cells 2021 apžvalga, apibendrinta metileno mėlynojo kaip galimo senėjimą slopinančio junginio apžvalgoje	Smegenų senėjimo, neurodegeneracijos, odos, žaizdų gijimo ir progerijos literatūros sintezė	Metileno mėlynasis apibūdinamas kaip katalizinis oksidacijos ir redukcijos ciklo dalyvis, galintis apeiti dalį elektronų pernašos per I ir III kompleksus, aptariant tai laisvųjų radikalų senėjimo teorijų kontekste	Tik naratyvinė sintezė. Joje sisteminamos hipotezės ir nurodoma, kur klinikiniai įrodymai tebėra nepakankami galutinėms išvadoms.

Bendra visų eilučių tendencija svarbesnė nei bet kuri atskira eilutė. Mažos metileno mėlynojo dozės pakartotinai siejamos su ilgesne proliferacijos trukme, didesniu IV komplekso aktyvumu, mažesniais oksidantų signalais ir pagerėjusia morfologija. Tyrimų schema išlieka išilginė: pradedama nuo besidalijančių ląstelių, junginys naudojamas joms dauginantis ir registruojama, kiek laiko dalijimasis tęsiasi. Tokia schema gali pagrįsti teiginį apie atitolinimą. Be kitokios tyrimo schemos ji negali pagrįsti teiginio apie pašalinimą.

Senescencijos atitolinimas nėra senescentinių ląstelių pašalinimas

Atitolinimas reiškia, kad besidalijančios ląstelės ilgiau dalijasi, kol jų dalijimasis sustoja. Pašalinimas, dažnai vadinamas senolitiniu poveikiu, reiškia, kad jau senescentinės ląstelės selektyviai sunaikinamos arba jų skaičius sumažinamas, o kaimyninės proliferuojančios ląstelės išlieka gyvos.

Metileno mėlynojo tyrimai su fibroblastais tikrina pirmąją schemą. Iš pradžių kultūros proliferuoja, junginys naudojamas nuoseklaus persėjimo metu, o dalijimasis sustoja vėliau. Todėl tokie žymenys kaip SA-beta-gal, p16, p21 ir SASP veiksniai atsiranda vėliau arba tam tikro persėjimo metu jų kiekis būna mažesnis. Tokio pobūdžio rezultatas tikėtinas visada, kai senescencijos pradžia pasislenka. Jis neįrodo, kad buvo pašalinta bent viena jau senescentinė ląstelė.

Teiginiui apie senolitinį poveikį pagrįsti reikėtų kitokios schemos: pirmiausia kultūroje sukelti patvirtintą senescenciją, tada panaudoti junginį ir tiesioginiais gyvybingumo bei žūties matavimais parodyti selektyvų šių senescentinių ląstelių praradimą, palyginti su proliferuojančiomis kontrolinėmis ląstelėmis. Vien žymens sumažėjimo nepakanka, nes raiška gali pakisti neprarandant ląstelių, o likusios proliferuojančios ląstelės gali peraugti kultūrą. Nė viename iš keturių cituojamų šaltinių metileno mėlynajam netaikoma tokia selektyvaus ląstelių skaičiaus mažinimo schema, todėl tikslus apibūdinimas tebėra senescenciją atitolinantis arba ją slopinantis aktyvumas in vitro, o ne senolitinis poveikis. Su oksidaciniu stresu susijusi šio skirtumo pusė išsamiau paaiškinama straipsnyje apie tai, kaip ląstelės kontroliuoja reaktyviąsias deguonies formas.

Trumpalaikio signalinio atsako rezultatas dar labiau išryškina šį skirtumą. 2015 metų IMR90 tyrime metileno mėlynasis sukėlė trumpalaikį NAD ir NADH santykio padidėjimą bei trumpalaikį AMPK fosforilinimą, po kurių vyko PGC-1alpha ir SURF1 indukcija; abu šie veiksniai susiję su IV komplekso biogeneze. Ilgalaikė AMPK aktyvacija naudojant AICAR lėmė gerokai mažiau papildomų padvigubėjimų.

Replikacinė gyvavimo trukmė nėra žmogaus ilgaamžiškumas

Ląstelių replikacinė gyvavimo trukmė nusako padvigubėjimų skaičių iki dalijimosi sustojimo kontroliuojamoje kultūros lėkštelėje, esant pastovioms deguonies, terpės ir persėjimo ritmo sąlygoms. Žmogaus ilgaamžiškumas apima dešimtmečius trunkančią raidą, imuninės sistemos ir kraujagyslių veiklą, kamieninių ląstelių nišas, elgseną ir ligas. Junginys gali pailginti pirmąją trukmę nepakeisdamas antrosios, ir dauguma jų taip ir veikia.

Progerijos fibroblastai turi konkrečią LMNA mutaciją, dėl kurios susidaro progerinas; jiems būdingos fragmentuotos ir mažiau judrios mitochondrijos, mažas ATP kiekis, netaisyklingos formos branduoliai ir heterochromatino praradimas. Nanomolinių koncentracijų metileno mėlynasis pagerino mitochondrijų rodiklius ir reikšmingai pakoregavo branduolio rodiklius, įskaitant progerino atsiskyrimą nuo membranos. Tai ryški korekcija ląstelių lygmeniu. Vis dėlto tai tebėra fibroblastų tyrimo rezultatas, o autoriai tyrimus su gyvūnais nurodė kaip būsimą darbą. Pats ligos modelis išsamiau aptariamas straipsnyje apie metileno mėlynąjį progerijos ir priešlaikinio senėjimo modeliuose.

Iš to galima sudaryti praktinį tyrimų vertinimo sąrašą.

Klauskite, ar junginys pradėtas naudoti prieš sustojant dalijimuisi, ar jau patvirtinus jo sustojimą. Naudojimas prieš sustojimą pagrindžia atitolinimą. Pašalinimui pagrįsti reikia naudojimo po sustojimo ir selektyvios žūties duomenų.
Klauskite, kaip kito kontrolinės kultūros padvigubėjimų kreivė. Be bendro padvigubėjimų skaičiaus žymenų pokyčiai lieka be konteksto.
Reikalaukite bent dviejų žymenų klasių, pavyzdžiui, proliferacijos žymens kartu su p16 arba p21 ir SA-beta-gal, o ne vieno dažymo.
Klauskite, kaip pateikti telomerų duomenys. Trumpėjimo greitis per padvigubėjimą, stebimas laikui bėgant, yra prasmingas. Vienkartinis ilgio matavimas – ne.
Klauskite, kokios sąlygos išlaikytos pastovios. Persėjimo tankis, deguonis, terpės keitimas ir švieži ar ilgiau laikyti metileno mėlynojo pradiniai tirpalai keičia fibroblastų dalijimosi sustojimą.

Taip vertinami fibroblastų tyrimai suteikia metileno mėlynajam nuosekliai pagrįstą, bet ribotą vaidmenį: tai mažomis dozėmis naudojamas oksidacijos ir redukcijos reakcijose aktyvus junginys, kuris atitolina kultivuojamų žmogaus fibroblastų replikacinę senescenciją ir kartu pagerina mitochondrijų rodiklius. Išsamiausi mechanistiniai duomenys susiję su trumpalaikiu energinės būsenos signalų perdavimu ir IV komplekso biogeneze, tačiau šiuose straipsniuose neparodytas nei senescentinių ląstelių pašalinimas, nei žmogaus gyvenimo trukmės pailgėjimas.