Straipsnis
Metileno mėlynasis ir išsėtinė sklerozė: kas tirta eksperimentuose su gyvūnais
Ieškodami informacijos apie metileno mėlynąjį išsėtinei sklerozei (IS), rasite straipsnių, kurie, regis, atsako į tą patį klausimą. Tačiau taip nėra. Viename tyrime sergančioms pelėms metileno mėlynasis buvo skiriamas kaip gydymo priemonė. Kitame juo negydytas nė vienas gyvūnas. Metileno mėlynasis naudotas kaip mėlynas dažiklis ploniems nugaros smegenų pjūviams nudažyti, kad patologas mikroskopu galėtų matyti mieliną.
Šis skirtumas yra viso straipsnio pagrindas. Biologijoje šis dažiklis atlieka du vaidmenis, kuriuos sieja tik tas pats buteliukas. Kaip kandidatas į vaistus jis skiriamas gyvam gyvūnui, siekiant nustatyti, ar keičiasi ligos eiga. Kaip dažiklis jis po eksperimento naudojamas negyviems, fiksuotiems audiniams, siekiant nustatyti, kaip tie audiniai atrodė. Nepastebėję šio skirtumo, patologijos tyrimo metodų skyrių galite perskaityti taip, tarsi jame būtų pateikti gydymo rezultatai.
Kas yra EAE, paprastai
Eksperimentinis autoimuninis encefalomielitas, paprastai trumpinamas EAE, yra standartinis gyvūnų modelis, atspindintis tam tikrus išsėtinės sklerozės aspektus. Tyrėjas imunizuoja imlią pelę mielino baltymo fragmentu kartu su stipriu adjuvantu. Tuomet imuninė sistema puola paties gyvūno centrinę nervų sistemą. Pelei išsivysto kylantis silpnumas, kurį lengva įvertinti skalėje nuo 0 iki 5: nuo suglebusios uodegos iki užpakalinių galūnių paralyžiaus.
Toks vertinimo patogumas paaiškina ir EAE populiarumą, ir tai, kodėl šis modelis gali klaidinti. Žmonių IS išsivysto savaime, apima platesnį ir ne taip aiškiai apibrėžtą taikinių rinkinį bei sukelia regos, jutimo, pažinimo, smegenėlių funkcijos ir motorinius simptomus, o jos eiga gali būti recidyvuojanti arba progresuojanti. EAE kontroliuojamomis sąlygomis atkuria pasirinktus mechanizmus, tokius kaip uždegimas, demielinizacija ir aksonų pažaida. Tai nėra miniatiūrinė IS kopija. Skaitytojai, norintys bendro konteksto, prieš vertindami bet kurį teiginį apie konkrečią ligą gali pasidomėti, kaip, manoma, metileno mėlynasis veikia ląstelių lygmeniu.
Dviejuose toliau aptariamuose tyrimuose taip pat naudoti skirtingi EAE antigenai, ir tai svarbu. Gydymo tyrime liga sukelta naudojant MOG35-55 – trumpą mielino oligodendrocitų glikoproteino peptidą. Patologijos tyrime liga sukelta naudojant MP4 – mielino bazinio baltymo ir proteolipidinio baltymo segmentų junginį. Pasirinkta pelių linija ir antigenas keičia pažeidimų vietą bei uždegimo eigą, todėl šie du tyrimai nėra du to paties eksperimento pakartojimai.
Orientyras: modelis, klausimas ir ribos
Turėkite šią lentelę po ranka. Tai pagrindinis šio straipsnio orientyras. Kiekvienoje eilutėje nurodyta, į kokį klinikinį klausimą modelis gali atsakyti, kas iš tikrųjų matuota ir kur baigiasi rezultatų pritaikymo galimybės.
| Gydymo tyrimas (MOG EAE) | Patologijos tyrimas (MP4 EAE) | |
|---|---|---|
| Straipsnis | MOG peptidu sukelto EAE gydymo tyrimas | Ilgalaikis MP4 patologijos tyrimas |
| Metileno mėlynojo vaidmuo | Gyvoms pelėms skirta intervencija | Dažiklis, naudotas fiksuotiems 1 mikrometro storio nugaros smegenų pjūviams |
| Klinikinis klausimas, į kurį gali atsakyti | Ar preparato skyrimas keičia EAE sunkumą ir imuninę signalizaciją | Kaip per šešis mėnesius kinta demielinizacija ir aksonų pažaida |
| Vertinimo rodikliai | Kasdieniai klinikiniai balai, nugaros smegenų infiltratai, demielinizacija, aksonų pažaida, AMPK ir SIRT1 signalizacija, NF-kB aktyvumas, Th17 ir Treg pusiausvyra | Pažeidimų plotas, uždegimo ir edemos laipsniai, demielinizuotų skaidulų tankis, g santykis pagal elektroninę mikroskopiją, aksolizė, mitochondrijų brinkimas, atstumai tarp neurofilamentų |
| Rezultatų pritaikymo ribos | Viena pelių linija, viena lytis, trumpa 30 dienų trukmės eiga, sąsaja, o ne mechanizmo įrodymas | Gydymas netirtas, audinių mėginiai imti skerspjūvio principu, pažeidimų mėginiai daugiausia iš juosmeninės nugaros smegenų dalies |
Vertindami kitą antraštę, galite pasitelkti tuos pačius stulpelius ir straipsnį apie tai, kaip skaityti ikiklinikinius tyrimus: išsiaiškinkite rūšį ir antigeną, junginio vaidmenį, vertinimo rodiklius bei tai, ar rezultatas atspindi ligos eigą, ar audinių būklę konkrečiu momentu.
Gydymo rezultatas: ką pakeitė preparato skyrimas
2016 metų gydymo tyrime, paskelbtame žurnale „Journal of Neuroimmunology“, naudotos maždaug 8–10 savaičių amžiaus C57BL/6 pelių patelės, imunizuotos skiriant po 250 mikrogramų MOG35-55 kiekvienai pelei. Sukėlus ligą, EAE sergantys gyvūnai atsitiktinai paskirstyti į metileno mėlynojo grupę arba negydomą EAE grupę, o klinikiniai balai stebėti maždaug iki 30 dienos.
Nuo 15 iki 30 dienos gydytų pelių klinikiniai balai buvo reikšmingai mažesni nei EAE kontrolinės grupės pelių; P buvo mažesnis nei 0.01. Nugaros smegenų analizė rodė tą pačią kryptį: gydytų gyvūnų uždegiminė infiltracija, demielinizacija ir aksonų netekimas buvo mažesni.
Išskirtinė tyrimo dalis buvo signalizacijos rodiklių rinkinys. Gydymas padidino AMPK aktyvaciją ir SIRT1 raišką bei slopino NF-kB – pagrindinio uždegimo reguliatoriaus – aktyvaciją. Kalbant apie adaptyvųjį imunitetą, gydymas sumažino Th17 atsaką ir sustiprino Treg atsaką. Taigi siūloma tokia grandinė: metileno mėlynasis veikia AMPK ir SIRT1, mažėja NF-kB signalizacija, uždegiminį Th17 atsaką keičia reguliacinis Treg atsakas, audinių pažaida tampa lengvesnė, o klinikiniai balai – mažesni.
Ši grandinė yra interpretacija, o ne įrodyta priežastinė seka. Tyrimas rodo, kad preparato skyrimas, signalizacijos pokyčiai ir ligos būklės pagerėjimas stebėti kartu. Jis neįrodo, kad visą teigiamą poveikį lemia AMPK ir SIRT1, o viešai indeksuotame tekste tiksli dozė miligramais kilogramui, vartojimo būdas, skyrimo pradžios diena ir trukmė pateikti nepakankamai aiškiai, kad režimą būtų galima atkurti vien iš santraukos. Bet kokį pardavimo puslapyje nurodytą šio tyrimo dozavimo skaičių laikykite nepatikrintu, jei jis nepagrįstas viso straipsnio metodų skyriumi. Platesnėje metileno mėlynojo tyrimų su žmonėmis įrodymų bazėje reikėtų tikrinti, ar šis ankstyvas imuninio poveikio požymis kada nors buvo pagrįstas klinikiniais duomenimis.
Patologijos rezultatas: ką parodė šešių mėnesių audinių tyrimai
2015 metų MP4 tyrime, paskelbtame žurnale „PLoS ONE“, naudotos C57BL/6 pelių patelės, imunizuotos 200 mikrogramų MP4 su pilnu Freundo adjuvantu, taip pat skiriant kokliušo toksino imunizacijos dieną ir dar kartą po 48 valandų. Nė vienam gyvūnui metileno mėlynasis neskirtas kaip vaistas. Po fiksavimo ir įliejimo į terpę vieno mikrometro storio skersiniai nugaros smegenų pjūviai dažyti metileno mėlynuoju šviesinei mikroskopijai, o smulkesnėms detalėms tirti atlikta ventrolateralinio laido elektroninė mikroskopija.
Audinių mėginiai imti trimis etapais: ūminės fazės piko metu iš 7 pelių, praėjus trims mėnesiams nuo ligos pradžios iš 5 pelių ir praėjus šešiems mėnesiams nuo ligos pradžios iš 10 pelių. Vidutiniai klinikiniai balai šiais etapais atrodė beveik vienodi – apie 1.7–1.8 skalėje nuo 0 iki 5. Audiniai atskleidė kitokį vaizdą. Skaidulų, kuriose pažeistas tik mielinas, tankis padidėjo nuo maždaug 569,000 skaidulų kvadratiniame milimetre ūminės fazės piko metu iki maždaug 1,496,000 po šešių mėnesių; skirtumas tarp ūminio ir ilgalaikio etapo buvo reikšmingas, P lygu 0.027. Bendras mielino ir aksono pažeidimas per šešis mėnesius maždaug padvigubėjo. Remielinizuojamų skaidulų dalis visais etapais išliko mažesnė nei vienas procentas – tai verčia atsargiau vertinti atsikūrimo viltis.
Aksonų pažaida kito pagal U formos kreivę: buvo didelė ūminės fazės piko metu, mažesnė po trijų mėnesių ir didžiausia po šešių mėnesių. Ji koreliavo su mitochondrijų brinkimu ir mažesniais atstumais tarp neurofilamentų. Vertinimas atliktas nežinant klinikinio balo ir etapo, o tai sustiprina išvadą, kad klinikiniai balai nepakankamai atspindėjo besitęsiančią struktūrinę pažaidą.
Šis neatitikimas yra tikroji tyrimo vertė skaitytojui, besidominčiam IS. Stabilus negalios balas nereiškė stabilios audinių būklės. Tai taip pat paaiškina, kodėl šiuo straipsniu negalima pagrįsti jokių teiginių apie IS gydymą metileno mėlynuoju. Jame tirtas laikas, o ne gydymas.
Kodėl nė vienas tyrimas neįrodo naudos pacientams
Kiekvieną straipsnį vertinkite kaip gerai atsakantį į siaurą klausimą, bet visai neatsakantį į klausimą apie poveikį pacientams.
Pirma, skiriasi priežastis. EAE tyčia sukeliamas konkrečiu antigenu ir adjuvantu. Žmonių IS išsivysto savaime, dalyvaujant platesniam imuninės sistemos komponentų rinkiniui: T ląstelėms, B ląstelėms, įgimtajam imunitetui ir audiniuose esančioms glijos ląstelėms. Junginys, pakeičiantis į MOG nukreiptą pelės imuninį atsaką, nebūtinai pakeis platesnį žmogaus atsaką.
Antra, skiriasi fenotipas. Kylantis pelės silpnumas nuo uodegos iki užpakalinių galūnių yra patogus vertinimo rodiklis. Jis sutraukia žmonių IS įvairovę į vieną motorinės funkcijos skaičių. Vaistai dažnai pakeičia trumpalaikius EAE balus, bet nepakeičia ligos eigos žmonėms, todėl EAE yra atrankos ir mechanizmų tyrimo priemonė, o ne miniatiūrinė klinika.
Trečia, lieka neaiški ekspozicija ir skyrimo laikas. Nepertraukiamas ankstyvas preparato skyrimas 30 dienų eksperimente su pelėmis nėra tas pats, kas ilgalaikis geriamasis vartojimas žmogui, kuriam liga jau išsivysčiusi. Be to, nė viename tyrime nematuota preparato koncentracija nervų sistemoje. Be šios sąsajos nėra pagrindo pereiti nuo koncentracijos laboratorinėje plokštelėje ar pelei skirtos dozės prie vartojimo režimo žmogui.
Ketvirta, šie du tyrimai vienas kito neatkartoja. Skiriasi antigenai, klausimai ir vertinimo rodikliai, o vienu atveju gydymo apskritai nebuvo. Cituoti juos kartu kaip du teigiamus IS gydymo tyrimus yra kategorijų supainiojimas.
Ką tai reiškia įrodymus vertinantiems skaitytojams
Šiuose straipsniuose nepateiktas nustatytas metileno mėlynojo vartojimo protokolas IS atveju. Gydymo tyrimas pagrindžia tolesnius AMPK, SIRT1, NF-kB ir Th17 bei Treg pusiausvyros tyrimus MOG EAE modelyje. Patologijos tyrimas primena, kad audinių pažaida gali progresuoti, nors balai atrodo nekintantys, ir kad metileno mėlynasis metodų skyriuje kartais reiškia dažiklio indelį, o ne vaistų spintelę. Skaitytojai, sekantys vykdomus išsėtinės sklerozės tyrimus, turėtų nepamiršti šio skirtumo tarp dažiklio ir vaisto. Saugumo klausimus, įskaitant su krauju ir sąveikomis susijusią riziką, reikėtų aptarti su gydytoju kartu su bendraisiais metileno mėlynojo saugumo duomenimis, prieš kam nors imantis veiksmų pagal laboratorinių tyrimų antraštes.
Esmė telpa į vieną sakinį. Viename cituojamame tyrime metileno mėlynasis skirtas MOG EAE sergančioms pelėms ir aprašyta lengvesnė liga bei priešuždegiminės krypties imuninio atsako pokytis, o kitame cituojamame tyrime jokio preparato neskirta ir metileno mėlynasis naudotas tik nugaros smegenims dažyti, dokumentuojant per šešis mėnesius besikaupiančią mielino ir aksonų pažaidą, todėl šie du tyrimai neįrodo, kad metileno mėlynasis padeda žmonėms, sergantiems IS.