Metileno mėlynasis ir feroptozė: lipidų peroksidacijos mechanizmas

Feroptozė yra ląstelės žūtis dėl membranos pažaidos. Membranose esantys polinesotieji riebalai oksiduojasi vykstant grandininei reakcijai, membrana praranda vientisumą, ir ląstelė žūsta. Šiems cheminiams procesams būtina geležis. Šis sakinys apima visą esmę, o visa šiame straipsnyje aptariama medžiaga tikrina kurią nors jos dalį.

Čia keliamas siauresnis klausimas: kaip metileno mėlynasis veikia šią grandinę eksperimentuose su ląstelėmis ir ką iš tiesų parodo toks rezultatas. Trumpas atsakymas: dviejuose laboratoriniuose tyrimuose nanomolinės koncentracijos metileno mėlynasis sumažino mitochondrijų lipidų peroksidaciją ir išlaikė ląsteles gyvas po poveikių, kurie kitu atveju sukelia feroptozę. Išsamesnis atsakymas svarbesnis, nes kiekviena grandinės grandis buvo tikrinama skirtinga intervencija, o kiekviena intervencija turi savo ribas.

Feroptozė vienoje pastraipoje

Membranos fosfolipidas, turintis polinesočiosios riebalų rūgšties uodegą, turi silpnąją vietą: vandenilio atomus, kuriuos lengva atplėšti. Radikalui atplėšus vieną iš jų, prie lipido prisijungia deguonis, susidaro lipido peroksilo radikalas, o šis atplėšia vandenilį nuo kito lipido. Reakcija plinta membrana, jei niekas jos nesustabdo.

Pagrindinis šios reakcijos stabdis yra fermentas GPX4, kuris, naudodamas glutationą, redukuoja lipidų peroksidus iki nekenksmingų lipidų alkoholių. Laboratoriniai feroptozę sukeliantys veiksniai šią apsaugą pažeidžia konkrečiose vietose. Erastinas blokuoja cistino patekimą per sistemą xc-minus, todėl ląstelei ima trūkti cisteino glutationo sintezei. Butionino sulfoksiminas tiesiogiai blokuoja glutationo sintezę. RSL3 slopina patį GPX4. Dėl visų trijų poveikių peroksidai lieka nepašalinti, tačiau veikiami skirtingi etapai, todėl rezultato, gauto su vienu veiksniu, negalima automatiškai taikyti kitiems.

Feroptozė nuo apoptozės skiriasi ją apibrėžiančiomis savybėmis. Nėra nei kaspazių kaskados, nei apoptozinių kūnelių. Geležies chelatoriai, tokie kaip deferoksaminas, ir radikalus sulaikančios medžiagos, tokios kaip ferostatinas-1, ją slopina. Būtent šiuo praktiniu kriterijumi tyrėjai remiasi priskirdami žūtį feroptozei, o ne vien nekrozei. Platesnis reguliuojamos ląstelių žūties kelių kontekstas padeda suprasti šį skirtumą, o tai, kaip ląstelės tvarko labiliąją geležį, paaiškina, kodėl chelatacija yra toks svarbus kontrolinis bandymas.

Koks mitochondrijų vaidmuo ir kodėl dėl jo buvo ginčijamasi

Ankstyvuosiuose darbuose buvo pranešta, kad ląstelės be mitochondrijų DNR vis tiek patiria feroptozę, todėl manyta, jog mitochondrijos nėra būtinos. Vėlesniuose darbuose nustatyta, kad mitochondrijų pašalinimas arba kvėpavimo blokavimas gali slopinti feroptozę, sukeltą cisteino trūkumo, bet ne tiesioginio GPX4 slopinimo. Abu rezultatai gali būti teisingi, jei mitochondrijų indėlis priklauso nuo sukeliančio veiksnio, ląstelės tipo ir vietos, kur vyksta lemiama peroksidacija.

Tyrime, kuriuo remiasi šis straipsnis, ginčas buvo nagrinėjamas naudojant konkrečiam ląstelės skyriui skirtą zondą. MitoCLox yra į mitochondrijas nukreipta lipidų peroksidacijos indikatoriaus versija: jo fluorescencija pakinta susidūrus su lipidų peroksilo radikalais mitochondrijų viduje. Erastinu paveiktuose fibroblastuose mitochondrijų zondo oksidacija pasireiškė dar gyvose ląstelėse, prieš jų žūtį, ir skyrėsi tarp populiacijos ląstelių. Ši įvykių seka svarbi. Prieš žūtį vykstanti peroksidacija gali būti jos priežastis. Tik jau žuvusiose ląstelėse išmatuota peroksidacija tėra liekanų požymis. Papildomame vadove apie lipidų peroksidacijos tyrimus ir tai, ką rodo kiekvienas zondas paaiškinama, kodėl zondo vieta lemia signalo reikšmę.

Toks pat dėsningumas pasireiškė ir antrajame modelyje. Paciento, sergančio Leberio paveldimąja optine neuropatija, fibroblastai, turintys I komplekso mutaciją ir didesnį pradinį oksidacinį stresą, išsekus glutationo atsargoms žuvo dėl feroptozės, o kontroliniai fibroblastai išliko atsparūs. Mitochondrijų zondo oksidacija ir vėl pasireiškė pirmiau. Išsami informacija pateikta mitochondrijų lipidų peroksidacijos feroptozės metu tyrime su fibroblastais.

Ką metileno mėlynasis pakeitė šiuose eksperimentuose

Metileno mėlynasis yra oksidacijos ir redukcijos reakcijų nešiklis. Jo oksiduota forma priima elektronus iš su NADH susijusių reakcijų ties I kompleksu, o redukuota forma perduoda juos citochromui c, kuris tiekia elektronus IV kompleksui. Taip susidaro dalinis aplinkkelis aplink grandinės atkarpą, kurioje elektronai paprastai nuteka į deguonį ir sudaro superoksidą. Norintiems suprasti visą perdavimo seką verta pradėti nuo straipsnio apie tai, kaip metileno mėlynasis perneša elektronus mitochondrijose.

Erastinu paveiktuose plaučių fibroblastuose 250 nanomolinės koncentracijos metileno mėlynasis išsaugojo gyvybingumą, vertintą ląstelių išgyvenamumo tyrimu, kaip ir į mitochondrijas nukreipti antioksidantai SkQ1 bei MitoTEMPO. Kontroliniai bandymai apibrėžia, ką galima teigti. Ferostatinas-1, alfa-tokoferolis ir deferoksaminas taip pat apsaugojo ląsteles, patvirtindami, kad žūtis buvo feroptozinė. SkQ1 analogas be antioksidacinės grupės neapsaugojo, o tai rodo oksidacijos ir redukcijos reakcijų, o ne nespecifinio kaupimosi reikšmę. Apsauga silpnėjo viršijus maždaug 200 nanomolinę SkQ1 koncentraciją, ir tai atitinka žinomą chinonų antioksidantų prooksidacinį poveikį esant didesniam jų kiekiui. Metileno mėlynojo poveikis taip pat dvejopas ir priklauso nuo dozės: šiose kultūrose maža nanomolinė koncentracija apsaugojo, tačiau didesnė koncentracija arba stiprus apšvietimas gali skatinti vandenilio peroksido susidarymą vykstant oksidacijos ir redukcijos ciklams. Tokio pobūdžio dozės kontekstas aptariamas straipsnyje apie reaktyviąsias deguonies formas mitochondrijose.

Vėliau eksperimentais su izoliuotomis mitochondrijomis buvo atskirti ROS šaltiniai. Esant dvivalentei geležiai, elektronus I kompleksui tiekiantys substratai kartu su rotenonu skatino zondo oksidaciją. Rotenonas blokuoja elektronų perdavimą už flavino vietos, todėl ankstesni grandinės nešikliai lieka redukuoti, o elektronai iš į matriksą nukreipto flavino nuteka į deguonį. Elektronus III kompleksui tiekiantys substratai kartu su antimicinu A sukėlė gausų vandenilio peroksido susidarymą, tačiau neskatino lipidų peroksidacijos. Toks pat bendras ROS signalas, bet kita vieta ir kitoks rezultatas. SkQ1 ir metileno mėlynasis slopino I komplekso skatinamą peroksidaciją, neslopindami paties vandenilio peroksido susidarymo. Tai rodo, kad jų poveikis pasireiškia po ROS susidarymo, lipidų peroksidacijos etape.

Geležies pertekliaus tyrimo dalis ir lipofuscino užuomina

Antrajame tyrime klausimas buvo nagrinėjamas iš geležies pusės. H9c2 kardiomiocituose, paveiktuose mažesnės nei milimolinės koncentracijos geležies(III) amonio citratu, pirmiausia susidarė mitochondrijų ROS, vėliau vyko mitochondrijų lipidų peroksidacija, tada feroptozė, o po jos per 24 valandas susikaupė į lipofusciną panašaus pigmento. Lipofuscinas yra autofluorescuojanti, geležies turinti oksiduotų lipidų ir baltymų liekana, kuri kaupiasi su amžiumi. Spartus jo atsiradimas šiame tyrime susieja ūmią geležies skatinamą peroksidaciją su klasikiniu senėjimo žymeniu. Nanomolinės koncentracijos metileno mėlynasis ir SkQ1 užkirto kelią tiek peroksidacijai, tiek žūčiai, tiek pigmento kaupimuisi. Izoliuotos širdies mitochondrijos patvirtino šį dėsningumą: rotenonas kartu su dvivalente geležimi skatino peroksidaciją ir į pigmento signalą panašų signalą, o abi medžiagos šiuos reiškinius blokavo. Visa seka aprašyta geležies pertekliaus tyrime su H9c2 kardiomiocitais. Pigmento aspektas siejasi su tema apie lipofusciną ir ląstelių senėjimo žymenis.

Ko neparodo ląstelių išgyvenamumo tyrimai

Gyvybingumo rodiklis, pavyzdžiui, CellTiterBlue, parodo, kiek ląstelių kultūroje išlieka metaboliškai aktyvios po jas žalojančio veiksnio ir galimai apsaugančios medžiagos poveikio. Tai mechanizmo patikrinimas apibrėžtoje sistemoje. Tai nėra gydymo rezultatas. Nė viename iš šių eksperimentų medžiaga nebuvo skirta pacientui, nebuvo vertinta ligos baigtis ar nustatytas terapinis langas organizme.

Keturias ribas verta įvardyti aiškiai. Pirma, ląstelių tipų įvairovė maža: transformuoti plaučių fibroblastai, pirminiai odos fibroblastai, įskaitant vieną mitochondrinės ligos liniją, ir žiurkių kardiomiocitų linija, taip pat izoliuotos žiurkių širdies mitochondrijos. Jautrumas tarp linijų skyrėsi, o LHON linija buvo pasirinkta būtent dėl neįprastai didelio pažeidžiamumo. Antra, sukeliantys veiksniai yra kraštutiniai laboratoriniai poveikiai: visiškas pernašos arba sintezės blokavimas ir toks geležies kiekis, su kuriuo joks audinys ūmiai nesusidurtų. Trečia, koncentracijos negalima perskaičiuoti paprastu dauginimu. Nanomolinė koncentracija kultūros terpėje nėra žmogui skiriama dozė. Tarp kultūros ir žmogaus yra metileno mėlynojo pasiskirstymas, jo redukcija iki bespalvės formos kraujyje ir audiniuose, šviesos poveikis bei membranos potencialas. Ketvirta, zondai rodo tik savo ląstelės skyriaus procesus. MitoCLox oksidacija rodo, kad susidarė mitochondrijų lipidų radikalai; ji neparodo, ar plazminės membranos plyšimui, tikėtinam galutiniam įvykiui, buvo užkirstas kelias tiesiogiai, ar jo išvengta paveikus ankstesnius etapus.

Taigi pagrįstas teiginys yra toks: šiuose modeliuose I komplekso kilmės ROS kartu su geležimi skatina mitochondrijų lipidų peroksidaciją, kuri vyksta prieš feroptozę, o mažos koncentracijos metileno mėlynasis nutraukia šią atkarpą. Norint teigti ką nors daugiau, reikia kitokių eksperimentų su gyvūnais, o vėliau – su žmonėmis.