Metileno mėlynasis kaip antioksidantas ir prooksidantas: kas keičia rezultatą?

Tarkime, dvi laboratorijos tiria tą patį mėlyną dažiklį ir praneša priešingus rezultatus. Pirmojoje izoliuotos smegenų mitochondrijos geriau kvėpuoja ir pagamina daugiau ATP. Antrojoje tas pats preparatas išskiria gerokai daugiau vandenilio peroksido. Abu pranešimai teisingi. Jie apibūdina tą patį ciklą iš dviejų pusių, o painiava prasideda tada, kai skaitytojai vieną pusę palaiko visu paaiškinimu.

Klaida — klausti, kuri etiketė tinka molekulei. Metileno mėlynasis yra elektronų perdavimo tarpininkas, kaip platesniame kontekste rodo jo ląstelių biologijos taikinių žemėlapis. Oksiduotas dažiklis priima elektronus ir virsta bespalviu leucoMB. LeucoMB perduoda tuos elektronus toliau ir vėl tampa mėlynas. Tai, ką stebite, priklauso nuo to, kas elektronus atiduoda, kas juos priima ir ar sistema gali pašalinti pakeliui susidariusį vandenilio peroksidą. Vertėtų klausti ne to, ar dažiklis yra antioksidantas, o to, ką esamos sąlygos leidžia šiam tarpininkui daryti.

Ciklas, lemiantis abu poveikius

Tamsoje pagrindinis ciklas trumpas. NADH, NADPH arba kvėpavimo grandinės nešikliai redukuoja dažiklį. Tada redukuotas dažiklis gali dalyvauti konkuruojančiose reakcijose. Jis gali perduoti elektronus citochromui c ir palaikyti jų srautą aplenkiant pažeistą kompleksą, todėl blokuojant I arba III kompleksą iš dalies atsikuria kvėpavimas ir membranos potencialas. Arba jis gali perduoti elektronus tiesiogiai deguoniui — taip atkuriama mėlyna forma ir susidaro vandenilio peroksidas. Kadangi dažiklis regeneruojamas, nedidelis jo kiekis gali daug kartų kartoti šį ciklą, nuolat vartodamas redukcinius ekvivalentus ir gamindamas peroksidą.

Dar dvi reakcijų šakos visiškai pakeičia chemiją. Laisvasis varis arba geležis per Fentono tipo reakcijas paverčia šį difunduojantį peroksidą gerokai žalingesniais vietiniais oksidantais. Raudona šviesa atveria atskirą fotocheminę šaką, kurioje sužadintas dažiklis perduoda energiją deguoniui ir sukuria singuletinį deguonį — dalelę, išsamiai aptariamą I ir II tipo fotochemijos paaiškinime. Oksidacijos ir redukcijos ciklas tamsoje, metalų sustiprinta pažaida ir fotodinaminė pažaida yra trys skirtingi mechanizmai, kuriuos sieja ta pati pradinė molekulė.

Sąlygų ir rezultatų matrica

Toliau pateiktą lentelę verta išsisaugoti. Kiekvienoje eilutėje nurodytas vienas kintamasis, jo lemiama poveikio kryptis ir tai pagrindžiantis eksperimentas. Teigiama kryptis reiškia apsauginį poveikį arba pagerėjusį rodiklį. Nepalanki kryptis reiškia daugiau oksidantų, didesnį atsargų išeikvojimą arba didesnę pažaidą.

Svarbiausias yra bendras eilučių dėsningumas. Peroksido gamyba ir biologinė apsauga yra atskiros ašys. Poveikis tuo pat metu gali būti nepalankus pagal pirmąją ir teigiamas pagal antrąją.

Kodėl ta pati dozė duoda skirtingus atsakymus

Koncentracija lemia elektronų pernašos pajėgumą, o ne baigtį. Nepažeistų smegenų mitochondrijų tyrime peroksido išsiskyrimas iš smegenų mitochondrijų pastebimai didėjo nuo 50 nM, o aiškiai mitochondrijų DNR pažaidai tamsoje reikėjo 100 uM. Tai maždaug dviejų tūkstančių kartų skirtumas tarp pirmojo signalo ir genotoksiškumo, tačiau jis nėra saugumo riba. Vertinamos baigtys, ląstelinės sritys ir poveikio trukmė skiriasi, todėl šie skaičiai žymi skirtingus reiškinius, o ne vienos kreivės taškus. Dozės ir atsako aptarime toks skirtumas tarp silpno signalo ir didelės pažaidos nagrinėjamas platesniame hormezės kontekste.

Substratas lemia, kur elektronai patenka į sistemą. Su NADH susieti energijos šaltiniai suteikia dažikliui daug redukcinių ekvivalentų tiek naudingam apėjimo keliui, tiek neproduktyviai reakcijai su deguonimi. Dažnai cituojama išvada, kad dėl sukcinato dažiklis tampa antioksidantu, o dėl glutamato — prooksidantu, pernelyg plačiai interpretuoja duomenis. Širdies tyrime peroksido matavimo sąlygomis kartu su sukcinatu buvo ir rotenono, be to, naudotas kitas audinys ir kita dozė nei smegenų tyrime, kuriame nustatytas padidėjęs peroksido kiekis esant kiekvienam substratui ir kiekvienai kvėpavimo būsenai.

Šviesa pakeičia mechanizmą, o ne vien poveikio dydį. Aiškiausias kontrastas šiame tyrimų rinkinyje: 20 uM tamsoje nesukėlė aptinkamo poveikio mitochondrijų DNR fragmentams, o 20 uM veikiant raudonai šviesai pažeidė juos visus. Lyginant eksperimentą šviesoje su eksperimentu tamsoje, lyginama fotochemija ir oksidacijos bei redukcijos ciklas.

Metalai pakeičia oksidantą. Be metalų dažiklio ciklas tamsoje gamina peroksidą — difunduojančią molekulę, kurią ląstelės taip pat naudoja signalams perduoti. Kai yra prieinamo vario ar geležies, NADH redukuotas dažiklis skatina metalo redukciją, o redukuotas metalas šalia DNR paverčia peroksidą hidroksilo tipo arba vario peroksido dalelėmis. Taip neląstelinės sistemos tyrime su NADH ir metalų jonais tas pats pradinis dažiklis sukėlė tiek selektyvią mutacijų židinių, tiek plačiai paplitusią DNR pažaidą. Ar ši šaka bus svarbi, lemia metalų tvarkymas konkrečioje ląstelinėje srityje, o ne vien dažiklis.

Energinių substratų prieinamumas lemia, ar ląstelė gali padengti sąnaudas. Endotelio ląstelėse, veiktose nuo 2 iki 20 uM dažiklio, pašalinus gliukozę išryškėjo oksidacinė kaina, o aprūpinus gliukoze ji išnyko, nors gliukozė taip pat spartino dažiklio redukciją. Spartesnis ciklas su aprūpintomis gynybinėmis sistemomis yra palankesnis nei lėtesnis ciklas su išsekusiomis gynybinėmis sistemomis. Bet kokį teiginį apie oksidantus, kuriame neaptariamas gliukozės ar NADPH prieinamumas, laikykite neišsamiu.

Audinys lemia turimą biologinę įrangą. Endotelio ląstelės regeneruoja NADPH per gliukozės apykaitą ir turi citozolinių antioksidantų atsargų. Izoliuotos mitochondrijos viso to neturi. Išgryninta DNR neturi net taisymo mechanizmų. Vieno preparato rezultatas mažai ką leidžia numatyti apie kitus, todėl planuojamame straipsnyje apie audiniams būdingus atsakus šias sistemas reikės aiškiai atskirti.

Tiesioginis matavimas nėra vėlesnis gynybinis atsakas

Daugelyje tekstų suplakami du lygmenys, kuriuos eksperimentai atskiria. Vienu lygmeniu klausiama, kiek oksidantų atsirado. Kitu — kaip ląstelė į tai reagavo.

Amplex tipo peroksido tyrimai yra arčiausiai pirmojo lygmens, tačiau net jie rodo grynąjį srautą, t. y. gamybą atėmus suardymą ir pašalinimą. Smegenų mitochondrijų tyrimas nustatė pokyčius abiejose pusėse: susidarė daugiau peroksido, o pridėta vienkartinė peroksido porcija buvo šalinama lėčiau. Toliau priežastinėje grandinėje yra glutationo oksidacija, askorbato vartojimas, oksiduotas guaninas ir polimerazę blokuojančios DNR pažaidos. Kiekvienas žingsnis tarp oksidanto ir matuojamo rodiklio įterpia papildomų biologinių procesų.

Nrf2 valdomi antioksidaciniai fermentai ir mitochondrijų biogenezė priklauso antrajam lygmeniui. Tai prisitaikymo programos, kurias gali sužadinti silpnas peroksido impulsas. Smegenų mitochondrijų apsaugos tyrimo autoriai siūlo būtent tokį silpno streso sužadinimo mechanizmą, kartu pažymėdami, kad priežastinė grandinė per Nrf2 grindžiama ankstesniais darbais, o ne jų pačių išsamiu įrodymu. Po kelių valandų dėl naujų baltymų atsirandanti apsauga nereiškia, kad pradinės cheminės reakcijos buvo antioksidacinės. Tai reiškia, kad nedidelis prooksidacinis įvykis paskatino stipresnę gynybą. Tokių teiginių vertinimo gairės, įskaitant matavimo metodų ribas ir preparatų skirtumus, aptariamos metileno mėlynojo tyrimų skaitymo vadove.

Kodėl matavimo metodai nesutampa

Bendro pobūdžio zondas, pavyzdžiui, dihidrofluoresceinas, rodo bendrą zondo oksidaciją, o ne peroksido koncentraciją. Jis priklauso nuo peroksidazės ir hemo cheminių reakcijų ir gali neaptikti peroksido padidėjimo, kurį užfiksuoja sukalibruotas Amplex tyrimas. Smegenų mitochondrijų tyrime nustatytas smarkiai padidėjęs peroksido kiekis be atitinkamo superoksido signalo — tai perspėjimas necituoti jokio antioksidacinio teiginio remiantis vienu dažikliu pagrįstu matavimu. Optinis persidengimas yra pagrįstas kontrolės klausimas, nes dažiklis sugeria regimąją šviesą ties įprastomis sužadinimo ir emisijos juostomis. Tačiau kruopščiame tyrime matavimai buvo kalibruoti pagal žinomą peroksido kiekį, sumažintas sužadinančios šviesos poveikis beveik nepakeitė signalo, o lėtesnis peroksido pašalinimas patvirtintas atskiru elektrodu. Interferenciją reikia patikrinti, o ne laikyti automatiniu pagrindu atmesti rezultatus.

Kalcio rezultatas rodo tą patį tikslumo poreikį. Širdies tyrime ūmus dažiklio poveikis nepakeitė bendros kalcio apkrovos iki pralaidumo perėjimo, tačiau į diabetą orientuotame širdies mitochondrijų tyrime jis padidino kalcio įsisavinimo greitį blokuotose smegenų mitochondrijose. Skirtingos baigtys, skirtingos sistemos — jokio prieštaravimo.

Ką patikrinti prieš pasitikint išvada

Kiekvieną išvadą apie antioksidacinį ar prooksidacinį poveikį vertinkite kaip pranešimą apie konkrečią sistemą ir užduokite penkis klausimus. Kokia koncentracija ir kurioje ląstelinėje srityje? Koks elektronų donoras ir koks konkuruojantis akceptorius? Šviesoje ar tamsoje, kokio bangos ilgio šviesa ir kokia jos dozė? Kokie metalai prieinami ir kaip aprūpinamos energinių substratų bei antioksidantų atsargos? Ir kokiu metodu matuota — ar jis vertina oksidantų srautą, pažaidą, ar prisitaikymo atsaką? Pakeitus bent vieną atsakymą, ta pati molekulė matricoje gali pereiti nuo apsauginio prie žalojančio poveikio be jokio paradokso.