Ar metileno mėlis gali aplenkti mitochondrijų III kompleksą? Kodėl tyrimų rezultatai nesutampa

Dvi laboratorijos tyrė, ar metileno mėlis gali aplenkti užblokuotą mitochondrijų III kompleksą. Viena atsakė neigiamai. Kita – teigiamai. Abi turėjo duomenų.

Pirmajame tyrime, atliktame su pelių smegenų mitochondrijomis, nustatyta, kad dažiklis to padaryti negali. Antrajame, atliktame su trijų graužikų rūšių smegenų mitochondrijomis, nustatyta, kad iš dalies gali. Trečiasis tyrimas, atliktas su pelių kepenimis, dažnai minimas greta, tačiau jame tirta kas kita. Jo rezultatų nepriskyrus šiam klausimui, pusė painiavos išnyksta.

Nėra pagrindo skelbti apie universalų mechanizmą. Yra trys eksperimentai, kuriuose naudoti skirtingi blokatoriai, dozės ir matavimo rodikliai. Pirmiausia įvertinkite sąlygas. Tada paaiškės ir išvados.

Ką čia reiškia aplenkimas

Elektronai į grandinę patenka per I kompleksą (iš NADH) arba II kompleksą (iš sukcinato), per III kompleksą perduodami citochromui c, o tada per IV kompleksą – deguoniui. Pakeliui sukurtą gradientą ląstelė naudoja ATP gaminti.

Teiginys apie aplenkimą reiškia, kad metileno mėlis paima elektronus prieš blokavimo vietą ir perduoda juos už jos. Oksiduotas dažiklis priima elektronus iš NADH arba pradinių grandinės komponentų ir virsta leukometileno mėliu, o redukuota forma perduoda juos citochromui c arba grąžina į grandinę. Jei elektronai perduodami už blokavimo vietos, kvėpavimas ir membranos potencialas iš dalies atsikuria. Jei jie perduodami ties blokavimo vieta arba prieš ją, niekas neatsikuria.

Viena III komplekso ypatybė lemia didelę šio ginčo dalį. Komplekse vyksta Q ciklas, turintis dvi inhibitorių prisijungimo vietas. Antimicinas jungiasi prie Qi vietos. Miksotiazolas jungiasi prie Qo vietos. Tyrimas, kuriame naudojamas tik vienas iš jų, patikrina tik pusę komplekso.

Pirmasis tyrimas: pelių smegenų mitochondrijose aplenkimo nėra

Gureev ir kolegos naudojo C57BL/6 pelių smegenų žievės mitochondrijas, išskirtas naudojant digitoniną; tyrimuose baltymo koncentracija buvo 0.1 mg/ml. Taikyti trys substratų deriniai: piruvatas ir malatas, kiekvieno po 5 mM, 10 mM sukcinatas su 2 mM glutamatu ir 10 mM L-prolinas. Blokatoriai buvo 1 mikromolinės koncentracijos rotenonas (I kompleksui) ir 1 mikrogramo/ml koncentracijos antimicinas (III kompleksui). Dažiklio koncentracijos buvo 0.5, 1 ir 2 mikromolinės, o pagrindinė koncentracija – 1 mikromolinė. Metodai ir registravimo kreivės pateikti „FEBS Letters“ publikacijoje.

I komplekso aplenkimas veikė. Rotenonas sumažino ADP skatinamą kvėpavimą nuo maždaug 121 iki maždaug 2 nmol per minutę vienam mg, o 1 mikromolinės koncentracijos dažiklis jį atkūrė iki maždaug 21. Membranos potencialas atsikūrė naudojant piruvatą su malatu ir L-proliną.

III komplekso aplenkimas neveikė. Antimicinas sumažino kvėpavimą iki maždaug 16, o dažiklis jį padidino tik iki maždaug 20. Membranos potencialas neatsikūrė naudojant nė vieną substratą, net esant dažiklio koncentracijoms iki 5 mikromolinių. Peroksido duomenys rodė tą patį: vien dažiklis padidino peroksido išsiskyrimą nuo bazinio, maždaug 76 pmol per minutę vienam mg, greičio iki maždaug 1170, 1460 ir 1945, esant trims minėtoms koncentracijoms, tačiau antimicinas šį dažiklio sukeltą signalą sumažino atitinkamai maždaug 25, 88 ir 96 procentais. Jei redukuotas dažiklis tiesiogiai reaguotų su deguonimi, III komplekso blokavimas neturėtų slopinti signalo. Autoriai padarė išvadą, kad redukuotas dažiklis oksiduojamas III komplekso Qo vietoje, prieš antimicino blokavimo vietą. Trumpasis ciklas žodžiais: iš donorų į dažiklį, iš dažiklio į Qo, toliau įprastu keliu. Rotenono blokavimas aplenkiamas. Antimicino – ne.

Antrasis tyrimas: dalinis aplenkimas trijose rūšyse, ties abiem inhibitorių prisijungimo vietomis

Svab ir kolegos išplėtė tyrimo planą. Pelių, žiurkių ir jūrų kiaulyčių smegenų mitochondrijos buvo išskirtos naudojant Percoll; tyrimuose taikyta tokia pati 0.1 mg/ml koncentracija, naudojant piruvatą su malatu arba glutamatą su malatu, kiekvieno po 5 mM. Naudoti du III komplekso blokatoriai: 0.3 mikromolinės koncentracijos antimicinas A ir 1 mikromolinės koncentracijos miksotiazolas. Daugumoje tyrimų dažiklio koncentracija buvo 2 mikromolinė, o tiriant citochromą c – 0.5. Visų trijų rūšių duomenys, gauti taikant suderintus protokolus, pateikti atvirosios prieigos straipsnyje.

Abu blokavimai buvo iš dalies aplenkti visose trijose rūšyse. Pelių mitochondrijose antimicinas slopino kvėpavimą, o dažiklis jį padidino maždaug 60 procentų – nuo maždaug 37 iki 59 nmol per minutę vienam mg. Miksotiazolas jį slopino 88 procentais, iki maždaug 4.5, o dažiklis jį padidino penkis kartus, iki maždaug 23. Naudojant bet kurį iš inhibitorių, membrana iš dalies repoliarizavosi; potencialas matuotas dviem dažikliais (safraninu O ir ratiometriniu TMRM), kad būtų atmesti optiniai artefaktai.

Šiame darbe elektronų perdavimas taip pat tirtas tiesiogiai – pirmajame tyrime to nedaryta. Egzogeninis acetilintas citochromas c, kurio koncentracija buvo 25 mikromolinė, nebuvo redukuojamas energizuotų mitochondrijų nei su inhibitoriais, nei be jų, tačiau pridėjus dažiklio redukcija vyko abiem atvejais. Buferyje be ląstelių NADH su dažikliu redukavo citochromą c greičiu, proporcingu NADH koncentracijai. Ilgesnis šuolis žodžiais: redukuojantieji ekvivalentai perduodami dažikliui, iš dažiklio – tiesiogiai citochromui c, per IV kompleksą – deguoniui. Šis kelias visiškai praleidžia III kompleksą, todėl abiejų blokatorių poveikį galima aplenkti.

Šį aiškinimą patvirtina dar du rodikliai. Pridėjus dažiklio prie miksotiazolu paveiktų mitochondrijų, NAD(P)H fluorescencija sumažėjo, vadinasi, redukuojantieji ekvivalentai buvo sunaudojami naujuoju keliu. Be to, dažiklio absorbcija ties 660 nm kito po kiekvieno pridėjimo, o centrifuguoti supernatantai parodė, kad oksiduoto dažiklio koncentracija energizuotų mitochondrijų viduje padidėja daugiau nei šimtą kartų ir jis pasišalina išnykus potencialui. Protonų balansas taip pat atitinka: praleidus protonų siurbimo etapus, vienai elektronų porai tenka maždaug 2 protonai vietoj 10, todėl spartesnis deguonies naudojimas ir tik dalinė repoliarizacija atspindi tikrą aplenkimą, o ne jam prieštarauja.

Tame pačiame preparate gauti atsakai rodo, kodėl paviršutiniškas duomenų vertinimas klaidina. Esant inhibitoriui ir dažikliui, ADP kvėpavimą mažino, o ne didino, ir pernašos blokavimas jį skatino, o ne lėtino, nors membranos potencialas vis tiek kito įprastomis kryptimis. Vien deguonies suvartojimas šioje sistemoje klaidina.

Trečiasis tyrimas: kepenų tyrimas, kuriame tirti I ir II, o ne III kompleksai

Lee ir Boelsterli naudojo pelių kepenų mitochondrijas ir kultivuojamus hepatocitus, pažeistus efavirenzu (I kompleksas, IC50 apie 30 mikromolinių) ir hidrazinu, izoniazido metabolitu (II kompleksas, IC50 apie 30 mikromolinių). Maždaug 30 mikromolinių koncentracijos dažiklis atkūrė NADH oksidaciją, membranos potencialą ir ATP, kartu mažindamas oksidantų kiekį ir nekrozinę ląstelių žūtį. „Redox Biology“ straipsnyje tai aiškinama modeliu, kuriame dažiklis perneša elektronus aplenkdamas pažeistus I ir II kompleksus.

Šis rezultatas yra patvirtintas ankstesnių grandinės etapų kontekstas ir nieko nepasako apie III kompleksą, nes šiame tyrime jis nebuvo blokuojamas. Rezultatas negali nei patvirtinti, nei paneigti nė vieno smegenų tyrimo.

Sąlygų matrica

Keturios priežastys, kodėl abu III komplekso tyrimai gali būti teisingi savo sąlygomis

1. Blokatoriaus poveikis nebuvo vienodas. Vien antimicinas, kurio koncentracija 1 mikrogramas/ml, lyginamas su 0.3 mikromolinės koncentracijos antimicinu ir atskiru Qo vietos blokatoriumi. Dažiklio kelias, perduodantis elektronus į Qo vietą, neveikia būtent ten, kur tiesioginis kelias į citochromą c veikia. Viena vieta negali atstoti abiejų.

2. Skyrėsi dažiklio dozė ir laikas. Pagrindinės koncentracijos buvo 1 ir 2 mikromolinės, o redokso cikle dalyvaujančio dažiklio patekimas į mitochondrijas ir tiesioginė citochromo c redukcija priklauso nuo koncentracijos ir laiko. Nedideli dozių skirtumai ir skirtingas matavimo laikas gali išryškinti skirtingas to paties tinklo atkarpas.

3. Skyrėsi preparatai. Išskyrimas naudojant digitoniną ir išskyrimas Percoll gradiente atrenka persidengiančias, bet netapačias mitochondrijų populiacijas. Baltymo koncentracija buvo vienoda – 0.1 mg/ml, todėl šis kintamasis atmetamas, tačiau subpopuliacijų ir vientisumo skirtumai išlieka. Rūšies skirtumo paaiškinimas taip pat atmestas: antroji grupė savo nustatytą atsaką atkartojo ir pelėse.

4. Substratų sąlygos lemia, ką dažiklis gali atlikti. Trys substratų deriniai lyginami su NADH susijusiomis poromis. NADH pasiūla ir membranos potencialas kartu lemia, kaip greitai dažiklis redukuojamas ir kur pasiskirsto, o keliui, kuriam reikia redukuoto dažiklio šalia oksiduoto citochromo c, šis pasirinkimas yra lemiamas.

Kaip vertinti kitą teiginį apie aplenkimą

Klauskite, kuris kompleksas buvo blokuojamas, kokiu inhibitoriumi, kurioje vietoje ir kokia doze. Klauskite, kokia buvo dažiklio koncentracija ir kada atliktas matavimas. Klauskite apie audinį, rūšį, išskyrimą, baltymo koncentraciją ir substratą. Taip pat klauskite, ar potencialo, kvėpavimo, redokso būsenos ir tiesioginio elektronų perdavimo tyrimo rezultatai sutampa, nes vien deguonies suvartojimas čia ne kartą vedė prie klaidingos išvados.

Siaura išvada išlieka pagrįsta. Sutariama, kad dažiklis aplenkia I kompleksą. Kalbant apie III kompleksą, pelių mitochondrijose, naudojant 1 mikrogramo/ml koncentracijos antimiciną ir 1 mikromolinės koncentracijos dažiklį, funkcinio aplenkimo nėra, o trijose rūšyse, naudojant 0.3 mikromolinės koncentracijos antimiciną arba 1 mikromolinės koncentracijos miksotiazolą ir 2 mikromolinės koncentracijos dažiklį, stebimas dalinis aplenkimas ir tiesioginis elektronų perdavimas iš dažiklio citochromui c. Abu teiginiai gali būti teisingi kartu. Bet kokia platesnė išvada yra ekstrapoliacija.

Susiję skaitiniai padeda ginčijamą teiginį vertinti neginčijamos chemijos kontekste: kaip metileno mėlis perneša elektronus – apie perdavimo grandinę, I komplekso aplenkimo eksperimentai – apie patvirtintą ankstesnio grandinės etapo atvejį, membranos potencialo matavimai ir jų artefaktai – apie tai, kodėl reikėjo dviejų dažiklių, o darbas laboratorijoje su redokso cikluose dalyvaujančiais junginiais – apie dozavimo ir laiko parinkimo spąstus.