Kodėl metileno mėlio sugertis keičiasi priklausomai nuo koncentracijos

Paimkite vieną metileno mėlio pradinio tirpalo butelį ir pripilkite dvi stiklines. Į pirmąją įpilkite pradinio tirpalo, o į antrąją – dešimt kartų praskiesto tirpalo. Kaip ir tikėtasi, antroje stiklinėje tirpalas blyškesnis. Įsižiūrėję pastebėsite ir kitą pokytį. Pasikeitė atspalvis. Vienas tirpalas artimesnis skaidriai dangaus mėlynai spalvai, o kitas – mėlynai su violetiniu atspalviu. Skiedimas ne tik sumažino intensyvumą. Jis pakeitė tai, kuri cheminė forma sugeria daugiausia šviesos.

Šį pokytį paaiškinanti mintis paprasta. Ištirpęs metileno mėlis nėra vienos cheminės formos. Pavienis dažiklio katijonas, vadinamas monomeru, gali susiglausti plokštumomis su antru katijonu ir sudaryti dimerą, o dimerai gali jungtis į didesnius agregatus. Kiekviena forma turi savą sugerties spektrą. Spektrofotometras parodo visų toje kiuvetėje tomis sąlygomis esančių formų sugerties sumą. Pakeitus mišinio sudėtį, spektras pasikeičia net tada, kai bendras dažiklio kiekis mažėja tiksliai pagal skiedimo santykį.

Monomeras ir dimeras šviesą sugeria skirtingai

Įsivaizduokite monomerą kaip plokščią kortelę, kurios teigiamas krūvis pasiskirstęs po žiedų sistemą. Dvi tokios kortelės gali susiglausti plokštumomis. Teigiami krūviai vienas kitą stumia, tačiau plokšti aromatiniai paviršiai traukia vienas kitą dėl sluoksniavimosi sąveikų, o aplinkinis vanduo ir priešjoniai ekranuoja atostūmį. Taip susidaro susieta pora su bendromis elektroninėmis būsenomis. Jos leidžiamieji šuoliai yra didesnės energijos nei monomero šuolis, todėl dimero juosta pasirodo ties trumpesniu bangos ilgiu nei monomero juosta, o didesni agregatai prisideda dar toliau mėlynosios spektro pusės link ir sudaro petį.

Esant labai mažai koncentracijai švariame vandenyje, vyrauja monomerai ir ilgųjų bangų juosta. Didėjant bendrajai koncentracijai, porinė forma sudaro vis didesnę dalį, o trumpesnių bangų juosta stiprėja pirmosios atžvilgiu. Todėl šių dviejų juostų santykis rodo mišinio sudėtį, o ne tiesiogiai bendrąją koncentraciją. Vieno bangos ilgio rodmuo negali atskirti šių dviejų formų be prielaidos, kuri iš jų yra tirpale.

Būtent todėl etaloniniai spektrai visada turi būti pateikiami kartu su sąlygomis. Metileno mėlio spektrinių duomenų žinyne juostų padėtys pateikiamos lentelėse kartu su tirpikliu, druskų fonu, pH, temperatūra ir koncentracijų intervalu, kuriame jos nustatytos. Nurodžius smailę be šių sąlygų, skaičius lieka nepakankamai apibrėžtas. Dvi laboratorijos gali teisingai apibūdinti skirtingus to paties dažiklio spektrus, nes matavo skirtingos sudėties mišinius.

Kas keičia pusiausvyrą

Koncentracija yra pagrindinis veiksnys. Dimerui susidaryti turi susitikti du monomerai, todėl jo dalis didėja sparčiau nei tiesiškai didėjantis bendras dažiklio kiekis. Paskelbtos dimerizacijos vandenyje konstantos artimoje kambario temperatūrai aplinkoje siekia tūkstančius atvirkštinių molinės koncentracijos vienetų, todėl dimerų dalis mikromolinių koncentracijų intervale staigiai didėja. Plačios apimties bendrasis modelio pritaikymas duomenims, apimantiems nuo mikromolinių iki milimolinių dažiklio koncentracijų, parodė nenulinį tetramerų indėlį jau esant mažesnei nei 34 mikromolių litre koncentracijai. Tai įspėja nepasikliauti griežtu dviejų formų modeliu, kai koncentracija siekia dešimtis mikromolių litre. Tikslios dalys priklauso nuo terpės, todėl šiame straipsnyje nurodomos pokyčių kryptys, o ne pateikiama universali perskaičiavimo lentelė.

Druska yra antrasis veiksnys. Ištirpę jonai ekranuoja dviejų katijonų atostūmį, todėl pridėjus natrio chlorido ar panašių elektrolitų, esant tai pačiai dažiklio koncentracijai, mišinyje daugėja dimerų ir agregatų. Šis poveikis matomas metileno mėlio agregacijos druskos tirpaluose ir vandeninėse terpėse tyrimuose, kuriuose buvo matuojami maždaug nuo 1 mikromolio litre iki 3.4 milimolio litre koncentracijos dažiklio tirpalai, o natrio chlorido koncentracija svyravo nuo 0 iki 0.15 molio litre. Šiame duomenims pritaikytame modelyje tetramerų dalis pasiekė maždaug 0.93, kai ir dažiklio, ir druskos koncentracijos buvo didelės. Todėl vandenyje ir fiziologiniame druskos tirpale užregistruoti spektrai nėra tarpusavyje pakeičiami etalonai.

Temperatūra veikia priešinga kryptimi. Sluoksniuojantis išlaisvinamas susietas vanduo, o šiam procesui priešinasi šiluminis judėjimas, todėl šildant tirpalą dalis dimerų paprastai disocijuoja į monomerus, o vėsinimas skatina asociaciją. Pagal duomenis nustatyta disociacijos entalpija yra neigiama, maždaug minus 30 kilodžaulių moliui 282–333 kelvinų intervale, o tai patvirtina egzoterminę asociaciją. Šaltas mėginys, išmatuotas iškart išėmus iš šaldytuvo, gali atrodyti labiau agreguotas nei tas pats mėginys, išmatuotas jam pasiekus kambario temperatūrą.

Tirpiklis lemia pradinę pusiausvyrą. Vanduo dėl stipraus hidrofobinio poveikio skatina plokščius dažiklio katijonus sluoksniuotis. Alkoholiai, tokie kaip etanolis ir metanolis, geriau solvatuoja žiedus ir suardo agregatus, todėl esant tai pačiai dažiklio koncentracijai etanolyje monomerinė forma vyrauja labiau nei vandenyje. Aprotoniniai papildomi tirpikliai veikia taip pat: vandens ir DMSO mišiniuose, esant 293 kelvinų temperatūrai, pridėtas DMSO slopino dimerizaciją, o tai rodo, kad vandens struktūra skatina sluoksniavimąsi. Paviršinio aktyvumo medžiagas reikia vertinti atsargiai, nes jos gali veikti abiem kryptimis. Viršijus jų kritinę micelių koncentraciją, micelės gali solubilizuoti pavienius monomerus ir atkurti į monomero spektrą panašų spektrą. Žemiau šios ribos priešingo krūvio paviršinio aktyvumo medžiaga gali, priešingai, skatinti sluoksniavimąsi: esant 100 mikromolių litre dažiklio koncentracijai, SDS sukelta polimerizacija buvo didžiausia ties maždaug 4 milimolių litre SDS koncentracija, t. y. maždaug puse micelių susidarymo koncentracijos, o didesnės paviršinio aktyvumo medžiagos koncentracijos sukėlė persiskirstymą. Dažiklio ir tirpiklio sąveikų bei organizuotų terpių poveikio metileno mėlio spektrams tyrimai parodo, kaip stipriai stebimas juostas lemia artimiausia molekulinė aplinka, o ne vien bendroji koncentracija.

pH svarbus daugiausia kraštutinėmis sąlygomis. Artimame neutraliam pH intervale, naudojamame daugumoje laboratorinių darbų, metileno mėlis išlieka įprastos mėlynos katijoninės formos, o spektro pokyčius daugiausia lemia agregacija. Stipri rūgštis ar bazė, oksidacijos ir redukcijos reakcijos, dėl kurių susidaro bespalvė leukoforma, arba jungimasis prie baltymų ir dalelių sukuria papildomas būsenas, kurių neapima monomero ir dimero pora. Jei spektras pasikeičia pridėjus buferio, prieš priskirdami viską vien pH, patikrinkite, ar buferio sudėtyje nėra druskų ir jungimąsi skatinančių komponentų. Chemijos ir protonavimo žinyne šie cheminių formų tapatybės klausimai nagrinėjami atskirai nuo čia aptariamos agregacijos.

Kodėl Bero–Lamberto tiesė išlinksta

Bero–Lamberto dėsnis teigia, kad optinis tankis lygus sugerties koeficiento, koncentracijos ir optinio kelio ilgio sandaugai. Tai skaičiavimo dėsnis. Jis remiasi prielaida, kad skaičiuojami objektai nesikeičia keičiantis jų kiekiui: yra viena sugerianti cheminė forma, nekintantis spektras, nėra nuo koncentracijos priklausančių cheminių pokyčių, matavimui naudojama monochromatinė šviesa, nėra sklaidos ar pakartotinės emisijos, o šviesa iš tiesų nueina nurodytą kelią.

Agregacija pažeidžia pirmąją prielaidą. Formaliai bendras optinis tankis lieka visų formų indėlių suma: optinio kelio ilgis dauginamas iš kiekvienos formos sugerties koeficiento ir jos koncentracijos. Kiekvienai formai dėsnis galioja. Mišiniui jis negalioja, nes atskirų formų koncentracijos yra netiesinės bendro dažiklio kiekio funkcijos. Todėl optinio tankio ties monomero juosta kalibravimo kreivė pagal bendrą dažiklio kiekį labai praskiestų tirpalų srityje iš pradžių yra tiesi, o didėjant koncentracijai išlinksta žemyn, nes kiekvienas papildomas dažiklio kiekio prieaugis suteikia proporcingai mažiau monomero. Ties dimero juosta matuojama kreivė išlinksta į priešingą pusę. Agregacijos tyrimuose būtent šis mechanizmas nurodomas kaip stebimų nuokrypių nuo Lamberto–Bero dėsnio priežastis. Tiesės pritaikymas išlinkusioje srityje ir jos ekstrapoliavimas yra dažna klaida. Tiesė galioja tik tame intervale ir toje matricoje, kuriuose buvo sudaryta.

Skiedimas sukuria panašius spąstus. Praskiedus koncentruotą pradinį tirpalą, kad jis patektų į prietaiso matavimo diapazoną, cheminių formų santykis neišlieka toks pats. Praskiestame tirpale kiuvetėje pusiausvyra vėl nusistovi monomero naudai, todėl jo spektras teisingai apibūdina praskiestą mėginį, bet neteisingai – pradinį tirpalą. Atgalinis pradinio tirpalo spektro apskaičiavimas proporcingai didinant optinio tankio vertes leidžia atkurti bendro kiekio įvertį tik tuomet, jei kalibravimas jau įvertina šį poslinkį. Jis niekada neatkuria pradinės juostų formos. Lyginant koncentrato spektrą su praskiestu etalonu, lyginami du skirtingos sudėties mišiniai.

Optinio kelio ilgis yra rezultato dalis

Optinis tankis proporcingas atstumui, kurį šviesa nueina mėginyje. 10 mm kiuvetėje to paties tirpalo optinis tankis yra dešimt kartų didesnis nei 1 mm kiuvetėje. Šis santykis tikslus tik tam pačiam tirpalui, o dėl agregacijos ši sąlyga tampa esminė.

Praktiškai optinio kelio ilgis padeda išlikti tinkamame matavimo intervale. Ilgas kelias užtikrina jautrumą matuojant praskiestus, daugiausia monomerinius tirpalus. Trumpas kelias leidžia matuoti koncentruotą mėginį neperžengiant prietaiso skalės ir jo stipriai neskiedžiant, nes toks skiedimas iš naujo pakeistų pusiausvyrą. Agregacijos tyrimuose, iš kurių gauti pirmiau pateikti skaičiai, buvo taikomas būtent šis metodas: 1 centimetro kiuvetės naudotos 1.1–34 mikromolių litre dažiklio koncentracijoms, o 0.01 centimetro kiuvetės – nuo 94 mikromolių litre iki 3.4 milimolio litre koncentracijoms. Mažų tūrių matavimo platformos ir mikroplokštelių skaitytuvai turi savitą geometriją: trumpus, kartais kintamus optinius kelius ir paviršius, ant kurių gali adsorbuotis katijoninis dažiklis. Kartu su skaičiumi nurodykite optinio kelio ilgį, kaip spektrinių duomenų žinyne nurodomi tirpiklis ir druska. Optinis tankis be optinio kelio ilgio nėra rezultatas. Tai tik gandas.

Matavimo tvarką diktuoja pats mechanizmas. Prieš matuodami leiskite visiems mėginiams pasiekti tą pačią temperatūrą. Naudokite vienodo tipo ir vienodai orientuotas kiuvetes, atitinkamus tuščiuosius mėginius su tokiu pačiu druskų ir buferio fonu bei švarius stiklinius indus, nes metileno mėlis adsorbuojasi ant stiklo ir plastiko, o nusidažiusi kiuvetė išsaugo ankstesnio koncentruoto mėginio pėdsakus. Kai svarbi agregacijos kinetika, matuokite netrukus po paruošimo ir kiekvieną kalibravimo kreivę sudarykite tokioje pačioje matricoje ir su tokiu pačiu optinio kelio ilgiu kaip nežinomus mėginius. Vertindami vizualiai atminkite, kad akis yra prastas spektrometras. Ar tirpalo spalva gali patvirtinti grynumą, yra atskiras klausimas, į kurį atsakymas neigiamas, o agregacijos sukelti atspalvio pokyčiai – viena iš priežasčių.

Schema, kurią verta laikyti šalia prietaiso

Toliau pateiktame paveiksle straipsnio esmė sutraukta į vieną laboratorinę atmintinę. Trijuose tirpaluose yra tas pats dažiklis, tačiau skiriasi bendroji koncentracija ir druskų fonas. Jų scheminiai spektrai rodo, kaip didėjant sluoksniavimuisi ilgųjų bangų monomero juostos dalis mažėja, o trumpesnių bangų dimero juostos dalis didėja. Sąlygos nurodytos paveiksle, nes be jų kreivių negalima naudoti kitomis aplinkybėmis. Išmatuotų juostų padėčių nurodytomis sąlygomis ieškokite spektrinių duomenų žinyne. Kaip ištirpęs dažiklis patenka į ląsteles, skaitykite straipsnyje apie patekimą į ląsteles per redukciją ir pasiskirstymą. Kaip šviesos dozė ir geometrija papildomai lemia fotocheminių matavimų rezultatus, skaitykite straipsnyje apie šviesos poveikį ir matavimo geometriją.

Svarbiausia taisyklė susideda iš dviejų dalių. Spektras apibūdina kiuvetėje nurodytomis sąlygomis esantį mišinį. Tik tomis pačiomis sąlygomis sudaryta kalibravimo kreivė leidžia optinį tankį perskaičiuoti į bendrąją koncentraciją.