Metileno mėlio alternatyvos mikroskopijai

Paprastam bakterijų tepinėliui kristalinis violetas gali pakeisti metileno mėlyje, kai siekiama matyti ląstelių formą. Gyvoms ląstelėms geresnė alternatyva gali būti fazinis kontrastas visiškai be dažymo. Pasirinkimas priklauso nuo to, ką reikia stebėti.

Tarkime, du žmonės tiria tą pačią bakterijų kultūrą. Vienas nori atskirti lazdelės formos ląsteles nuo apvalių. Kitas nori sužinoti, ar apdorojimas sunaikino bakterijas. Dažiklis, suteikiantis pirmajam aiškų vaizdą, antrajam gali nesuteikti jokio naudingo atsakymo.

Prieš rinkdamiesi pakaitalą, užbaikite šį sakinį: „Man reikia stebėti ___ ___, o ląstelės turi / neprivalo išlikti gyvos.“ Šis sakinys apibrėžia, kokią užduotį turi atlikti dažiklis.

Pradėkite nuo mėginio ir klausimo

Pirmiausia nuspręskite, ar ląstelės turi išlikti gyvos, tada nustatykite, kokią savybę reikia stebėti:

Ląstelės turi išlikti gyvos: judėjimui ar formai stebėti apsvarstykite nedažytą fazinio kontrasto arba DIC metodą; branduolio DNR stebėti apsvarstykite Hoechst 33342 su fluorescencija; membranos vientisumui rinkitės validuotą tyrimą, pavyzdžiui, SYTO 9 su propidžio jodidu.
Ląstelėms nebūtina išlikti gyvoms: bakterijų morfologijai apsvarstykite paprastą dažymą kristaliniu violetu arba negatyvų dažymą nigrozinu; Gramo reakcijai naudokite visą dažymo pagal Gramą metodą; branduolio DNR fiksuotose ląstelėse apsvarstykite DAPI fluorescenciją.

Naudokite šią lentelę kiekvienos pasirinkimo šakos apribojimams palyginti. Tai metodų pasirinkimai, o ne nurodymai keisti buteliukus esamame protokole.

Ką reikia stebėti	Mėginys ir įranga	Galima alternatyva	Pagrindinis apribojimas
Bakterijų forma ir išsidėstymas	Paruoštas bakterijų tepinėlis; šviesaus lauko mikroskopija	Paprastas dažymas kristaliniu violetu	Parodo morfologiją; nenustato Gramo reakcijos ar gyvybingumo.
Ląstelių kontūrai tamsiame fone	Bakteriologinis preparatas; šviesaus lauko mikroskopija	Negatyvus dažymas nigrozinu	Paruošimas ir formulė yra svarbūs; nedažyta ląstelė nebūtinai yra gyva.
Gramo reakcija	Paruoštas bakterijų tepinėlis; šviesaus lauko mikroskopija	Visas dažymo pagal Gramą metodas	Reikalinga visa reagentų seka ir kontrolės.
Gyvų ląstelių judėjimas ar pokyčiai	Tinkamas drėgnas preparatas; fazinis kontrastas arba DIC	Be dažiklio	Reikalinga tinkama optika; kontrastas neidentifikuoja molekulės.
Branduolio DNR	Fiksuotos ląstelės; fluorescencija	DAPI	Reikalingi suderinami sužadinimo ir emisijos filtrai.
Branduolio DNR gyvose ląstelėse	Gyvos ląstelės; fluorescencija	Hoechst 33342	Patekimas į ląstelę neįrodo, kad vaizdinimo sąlygos yra nekenksmingos.
Bakterijų membranos vientisumas	Nefiksuotos bakterijos; fluorescencija	SYTO 9 su propidžio jodidu	Membranos dažymas yra netiesioginis gyvybingumo matas.

Paprastam tepinėliui metodą keiskite atsargiai

Kristalinis violetas yra praktiškas pasirinkimas, kai reikia vienspalvio bakterijų morfologijos vaizdo. FDA Bakteriologinės analizės vadove pateikiamos dvi kristalinio violeto formulės, tinkamos paprastam dažymui. Naudokite dokumentuotą formulę ir jai skirtą paruošimo metodą; vien dažiklio pavadinimas neapibrėžia paruošto naudoti reagento.

Kristalinis violetas taip pat naudojamas dažant pagal Gramą, tačiau dėl to paprastas dažymas kristaliniu violetu netampa dažymu pagal Gramą. ASM dažymo pagal Gramą protokole diferencinis rezultatas priklauso nuo nuosekliai naudojamų kristalinio violeto, jodo, išblukinimo ir kontrastinio dažymo. Praleidus šiuos etapus pasikeičia tai, ką galima nustatyti iš vaizdo. Šis skirtumas paaiškintas straipsnyje paprastas dažymas ir dažymas pagal Gramą.

Nigrozinas leidžia kontūrus išryškinti kitu būdu: jis patamsina foną, o bakterijų ląstelės išlieka palyginti šviesios. Merck nigrozino instrukcijose pateikiama svarbi detalė, kurios gali nebūti bendrame pakaitalų sąraše. Nurodytoje darbinėje formulėje yra formaldehido. Todėl iš žodžių „negatyvus dažymas“ negalima spręsti apie suderinamumą su gyvomis ląstelėmis, net jei pačios ląstelės atrodo nedažytos. Patikrinkite visą formulę ir mėginio paruošimą.

Gyviems mėginiams apsvarstykite optikos pakeitimą

Jei norite stebėti, kaip ląstelės juda ar dalijasi, papildomas dažiklis gali apsunkinti stebėjimą. Kaip Nikon paaiškina vadove apie kontrastą skaidriuose mėginiuose, fazinis kontrastas ir diferencinis interferencinis kontrastas, arba DIC, leidžia matyti mėginius dėl jų optinių savybių skirtumų. Šiais metodais galima matyti gyvas, nedažytas ląsteles, jei mikroskopas turi reikiamus komponentus.

Toks pasirinkimas leidžia išlaikyti preparatą nedažytą, tačiau pakeičia gaunamos informacijos pobūdį. Galite stebėti ribą ar judėjimą nežinodami, kuri molekulė sukūrė kontrastą. Jei klausimas susijęs su molekulės lokalizacija, rinkitės tinkamą žymėjimo metodą.

Kalbant apie branduolio DNR, Invitrogen DAPI ir Hoechst dažiklių palyginime atskiriamas įprastas DAPI naudojimas fiksuotoms ląstelėms nuo lengviau į ląsteles patenkančio Hoechst 33342, kuriam teikiama pirmenybė žymint gyvas ląsteles. Abiem atvejais reikalinga fluorescencinė įranga. Nė vienas iš jų nėra tiesioginis spalvoto šviesaus lauko dažiklio pakaitalas.

Dažiklio poveikį ir apšvietimą laikykite eksperimento sąlygomis. Kai matuojate ląstelių elgseną, palyginkite dažytus ir nedažytus preparatus.

Raudona ląstelė nebūtinai yra negyva ląstelė

SYTO 9 ir propidžio jodidas dažnai naudojami kartu bakterijų membranos vientisumui vertinti. BacLight vadove nepažeistos membranos siejamos su žaliu dažymu, o pažeistos membranos – su raudonu dažymu. Tokį aiškinimą reikia validuoti konkrečiam mėginiui.

Problemą iliustruoja 2019 m. Rosenberg ir kolegų tyrimas. 24 valandų E. coli bioplėvelėse ant stiklo, esančiose fosfatiniame buferiniame druskos tirpale, apie 96% ląstelių in situ atrodė teigiamos propidžio jodidui. Tačiau autoriai apskaičiavo, kad po surinkimo 82% ląstelių buvo kultivuojamos. Konfokaliniai vaizdai rodė ląsteles su žaliu vidumi po raudonai nusidažiusia medžiaga, o tai leido manyti, kad klaidinantį signalą sukėlė ekstraląstelinės nukleorūgštys.

Šie procentai apibūdina skirtingus tyrimo preparatų matavimus, o ne universalų korekcijos koeficientą. Praktinė išvada – patikrinti, kas sukėlė signalą. Bioplėvelėje nukleorūgščių dažiklis gali aptikti medžiagą tiek ląstelių išorėje, tiek pažeistų ląstelių viduje. Darydami išvadą apie gyvybingumą, tyrėjai rekomenduoja papildomus matavimus, pavyzdžiui, kultivavimą ar metabolinio aktyvumo vertinimą, kartu pripažindami, kad kiekvienas metodas turi apribojimų.

Patikrinkite, kas iš tikrųjų yra alternatyvoje

Alternatyviame dažymo metode vis tiek gali būti metileno mėlio. Vienas pavyzdžių – Giemsa: Merck savo produktą apibūdina kaip azuro, eozino ir metileno mėlio tirpalą, skirtą, be kita ko, kraujo ir kaulų čiulpų tepinėliams. Tai gali būti kitas metodas kitokiam mėginiui, tačiau jis neatitinka reikalavimo visiškai nenaudoti metileno mėlio.

Jei tam tikro junginio pašalinimas yra eksperimento dalis, prieš lygindami vaizdus patikrinkite reagento tapatybę ir formulę. Vadove apie methyl blue, methylene blue ir kitus panašiai pavadintus dažiklius aptariami pavadinimų skirtumai.

Prieš naudodami rezultatą patikrinkite pakeitimą

Taikydami naują metodą atlikite nedidelį palyginimą su reprezentatyviais mėginiais ir tinkama kontrole. Kai įmanoma, išlaikykite palyginamus mikroskopo nustatymus. Užrašykite reagento formulę, mėginio paruošimą, poveikio sąlygas ir vaizdinimo parametrus, kad geriau atrodantį vaizdą būtų galima ištirti, o ne tiesiog jam teikti pirmenybę.

Sėkmę vertinkite pagal pradinį klausimą. Morfologijos atveju įvertinkite, ar ląstelių ribos ir išsidėstymas išlieka aiškiai interpretuojami. Branduolių žymėjimo atveju įvertinkite signalo vietą ir foną. Vertindami gyvybingumą, reikalaukite daugiau įrodymų nei vien patrauklaus spalvų atskyrimo. Platesniame vadove apie dažymą metileno mėliu ir laboratorinį taikymą paaiškinta, kaip stebėjimas ir preparato paruošimas siejasi tarpusavyje.

Rinkitės alternatyvą, kuri išsaugo jums reikalingą matavimą. Spalva yra tik viena iš galutinio vaizdo savybių.