메틸렌 블루가 세포에 들어가는 방식: 환원, 재산화, 막 분배

배양 접시의 내피세포가 메틸렌 블루를 흡수하는 모습을 보면, 가장 당연해 보이는 해석이 사실은 틀린 해석입니다. 배양액의 파란색이 사라지고 세포 안에 파란 과립이 생기니, 염료가 파란 분자 상태로 막을 통과했을 것이라고 생각하기 쉽습니다. 하지만 실험 결과는 다릅니다. 파란 형태는 거의 통과하지 못합니다. 막을 통과하는 것은 무색의 형태이며, 세포 안에서 보이는 파란색은 도착한 뒤 내부에서 만들어집니다.

이처럼 통념과 반대인 과정은 염색으로 무엇을 알 수 있고 무엇을 알 수 없는지를 결정한다는 점에서 중요합니다. 파란 과립은 재산화되어 세포소기관에 갇힌 산화형 염료를 나타냅니다. 세포 안의 전체 염료량을 나타내지도, 환원형 염료의 양을 나타내지도 않으며, 생물학적 효과를 측정하지도 않습니다. 그 이유를 이해하려면 표면에서의 환원, 환원형의 확산, 내부에서의 재산화와 포획이라는 세 단계를 따라가면 됩니다.

두 형태는 서로 다른 분자처럼 행동합니다

산화형 메틸렌 블루는 평면 구조의 양전하를 띤 고리계입니다. 물에 녹고, 600에서 700 nanometers 부근의 빛을 강하게 흡수하며, 파란색으로 보입니다. 핵심은 전하입니다. 전하를 띠고 물과 친화적인 분자는 지질막을 쉽게 통과하지 못하므로, 문헌에서는 신중하게 ‘막을 통과하지 못한다’가 아니라 ‘상대적으로 막을 잘 통과하지 못한다’고 표현합니다.

류코메틸렌 블루라고 불리는 환원형 메틸렌 블루는 무색이고, 전하가 없으며, 지용성입니다. 전하가 사라지면 막은 더 이상 장벽으로 작용하지 않습니다. 환원된 분자는 쉽게 막을 가로질러 확산하며, 더 산화적인 구획 안에 들어가면 다시 전자를 잃고 파란색의 전하를 띤 형태로 돌아가 내부에 갇힐 수 있습니다. 따라서 염료의 산화환원 화학은 곧 그 수송 기전이기도 합니다. 전자 수가 바뀌면 투과성도 바뀝니다.

첫 단계에 필요한 전자는 세포 자체에서 나옵니다. 포유류 세포는 세포막을 가로지르는 전자 수송을 수행하여, 세포 내부의 공여체에서 표면의 수용체로 환원 당량을 전달합니다. 이러한 세포막 횡단 활성은 대부분의 세포 유형에서 발견되는 정상적인 세포 기능입니다. 티아진 염료를 처리하는 내피세포 표면의 환원효소도 한 가지 중요한 측면에서 다른 환원효소들과 비슷하게 작동합니다. 후속 단계를 중단시키는 농도의 시안화물과 아지드가 있어도 계속 작동한다는 점입니다. 이 단계들의 분리가 전체 설명의 핵심입니다.

분배 개념이 먼저 등장했고, 흡수를 거의 설명했습니다

1929년 록펠러 연구소의 매리언 어윈은 더 단순한 질문을 던졌습니다. 염료의 유입은 그저 물과 세포의 지방성 층 사이에서 일어나는 분배이며, 실험대에서는 클로로포름층이 그 지방성 층을 대신할 수 있지 않을까 하는 질문이었습니다. 어윈의 분광광도법을 이용한 침투 연구에서는 염료 수용액을 클로로포름과 함께 흔든 뒤, 유기상으로 이동한 물질과 살아 있는 조류 세포 안으로 들어간 물질을 비교했습니다.

이 연구의 두 가지 결과는 지금도 주목할 만합니다. 첫째, 상업용 메틸렌 블루 용액에는 현재 azure B라고 불리는 트리메틸 티오닌이 들어 있었으며, 이 불순물은 메틸렌 블루 자체보다 더 빠르게 침투했습니다. 특히 지용성 유리 염기 형태가 우세한 알칼리성 pH에서 그 차이가 두드러졌습니다. 메틸렌 블루가 들어간 것처럼 보인 현상 중 일부는 실제로 azure B가 선택적으로 들어간 것이었습니다. 둘째, pH는 이온화 상태를 결정함으로써 결과를 좌우했고, 손상된 세포는 온전한 세포보다 훨씬 많은 염료를 받아들였습니다. 분배계수와 전하 상태는 인공계와 살아 있는 세포가 각각 무엇을 흡수하는지 결정했으며, 두 계의 유사성은 세포 경계에 비수성 층이 있다는 생각을 뒷받침했습니다.

이 모델은 지질과 이온화의 중요성을 앞서 짚어냈지만, 원래 형태 그대로 분배되는 염료와 표면에서 화학적으로 변환된 뒤 다른 형태로 막을 통과하고 내부에서 원래 형태로 돌아오는 염료를 구별하지는 못했습니다. 이를 구별하려면 다른 실험이 필요했고, 그 실험은 70년 뒤 폐 내피세포에서 이루어졌습니다.

바깥에서 환원되고, 안에서 갇힙니다

머커와 동료들은 배양한 소의 폐동맥 내피세포를 이용해 세 단계의 과정을 제안했습니다. 산화형 염료가 세포 표면에서 무색의 친유성 형태로 환원되고, 환원형이 내부로 확산한 뒤, 세포 내 재산화를 통해 막을 통과하지 못하는 산화형이 다시 생성되어 축적된다는 것입니다. 이어진 내피세포의 티아진 흡수 연구에서는 특정 단계들을 차단하여 이 과정을 검증했습니다.

첫 번째 도구는 세포 안으로 들어갈 수 없는 전자 수용체인 페리시안화물이었습니다. 표면 효소가 세포 바깥에서 파란 염료를 무색 형태로 환원하면, 페리시안화물은 그 전자를 다시 빼앗아 염료가 막을 통과하기 전에 배양액에서 파란 염료를 재생할 수 있습니다. 페리시안화물이 과량으로 존재하는 동안에는(염료 10 micromolar에 대해 페리시안화물 50에서 500 micromolar) 염료 흡수가 거의 중단되었고, 페리시안화물이 소모된 뒤에야 정상 속도로 흡수가 재개되었습니다. 반응 속도 양상도 다른 방식으로 같은 사실을 보여주었습니다. 페리시안화물은 대체로 일정한 속도로 사라졌는데, 이는 일정한 표면 환원 흐름이 재순환 가능한 매개체에 전자를 공급한다는 설명과 일치했습니다. 반면 세포 밖의 염료는 남아 있는 양이 줄어들면서 지수적으로 감소했습니다. 일정한 흐름과 고갈되는 염료량이 함께 관찰된다는 것은 페리시안화물 신호가 염료 분자가 용액에서 빠져나가는 현상이 아니라 지속적인 환원을 나타낸다는 뜻입니다.

두 번째 도구는 막 통과 단계 자체를 없앴습니다. 연구진은 티아진 계열의 가까운 유사체인 톨루이딘 블루 O를 큰 폴리아크릴아미드 사슬에 결합했습니다. 이 사슬은 어느 산화 상태에서도 세포 안에 들어가기에는 너무 컸습니다. 그런데도 세포는 사슬에 묶인 염료를 환원했습니다. 따라서 환원에는 세포 내부로의 접근이 필요하지 않습니다. 이를 담당하는 기구는 표면에 노출되어 있거나 표면과 전기적으로 연결되어 있습니다.

이후에는 논문 제목의 근거가 된 단계 분리가 관찰되었습니다. 2 millimolar의 시안화물과 아지드는 염료 축적을 강하게 억제했으며, 현미경으로 보면 보통 핵 주위를 둘러싸던 짙은 파란색과 보라색 봉입체가 거의 사라졌습니다. 하지만 어느 억제제도 세포 외부의 환원을 늦추지는 않았습니다. 페리시안화물의 순환은 줄어들지 않고 계속되었으며, 막을 통과하지 못하는 고분자에 결합된 염료도 여전히 환원되었습니다. 차단은 후속 단계에서 일어났습니다. 시안화물과 아지드는 표면 환원이 아니라 세포 내부의 재산화와 격리를 막고 있었습니다. 세포 생존성 대조 실험도 이 해석을 뒷받침했습니다. 이러한 처리 중에도 세포는 세포질 표지 효소인 젖산 탈수소효소를 유지했으므로, 흡수 감소가 단순히 독성이나 막 파열 때문은 아니었습니다.

이 논문의 한 가지 주의점은 지금도 유효합니다. 파란 봉입체는 핵 안이 아니라 핵 주변에 있었고, 이는 세포소기관 내부에서 산화가 일어난다는 설명과 일치했지만, 연구에서는 어떤 소기관인지 확인하지 않았습니다. 다른 세포 유형에서 나타난 비슷한 양상은 빈약한 근거만으로 리소좀에 의한 것으로 불리기도 했습니다. 포획이 일어난다는 점은 확립된 것으로, 그 위치는 잠정적인 것으로 받아들여야 합니다. 전자가 다음으로 어디로 이동하는지 살펴보고 싶은 독자는 미토콘드리아 전자 수송과 산화환원 처리와 더 넓은 맥락의 경로별 흡수와 분포로 이어갈 수 있습니다.

염색은 노출량이 아닙니다

세 번째 연구는 이러한 흡수 과정이 생물학적 측정 결과와 연결될 때 무엇이 나타나는지 보여줍니다. 스콧과 동료들은 고리 모양의 당 분자인 메틸 베타 사이클로덱스트린이 메틸렌 블루에 직접 결합한다는 것을 발견했습니다. 포접 복합체의 결합 상수는 약 310 per molar였으며, 염료 이량체화의 결합 상수는 약 5846 per molar였습니다. L929 섬유아세포에서 이러한 결합은 세포 염색과 포도당 흡수 촉진을 모두 차단했습니다. 사이클로덱스트린과 미리 배양하면 파란색 염색이 방지되었고, 염색 후에 첨가하면 탈색이 빨라졌습니다. 세포에서 광학적 파란색 신호가 사라질수록, 활성화되었던 포도당 수송도 밀접하게 연동되어 감소했습니다.

저자들은 이 상관관계가 오래 지속되는 산화 스트레스 기전보다는 염료와 포도당 수송체 활성화 경로의 단백질 사이의 직접적인 상호작용을 더 뒷받침한다고 해석했습니다. 이 추론은 합리적이지만 한계가 있습니다. 이 실험은 해당 단백질을 특정하지 않았고, 수송체 자체에 결합한다는 것을 보여주지도 않았으며, 탈색과 효과 소실 사이의 상관관계만으로 모든 산화환원 매개 경로를 배제할 수는 없습니다.

오래 남는 교훈은 측정에 관한 것입니다. 광학적 염색은 눈에 보이는 산화형의 세포 관련 염료를 나타냅니다. 무색의 환원형 염료는 전혀 포착하지 못하므로, 옅게 보이는 세포에도 염료에 해당하는 물질이 남아 있을 수 있습니다. 또한 강하게 염색된 세포가 나타내는 것은 갇힌 산화형 염료이지, 조직의 전체 노출량이나 효과의 크기가 아닙니다. 같은 주의점은 더 큰 규모에도 적용됩니다. 서로 다른 세포 유형의 염색을 비교하거나 짙은 조직 절편을 더 높은 노출량의 증거로 취급하는 것은 배양 접시에서 했던 최초의 오해를 되풀이하는 일입니다. 흡수는 환원, 확산, 재산화의 순환이며, 파란 형태를 한 시점에 관찰한 모습은 그 순환의 한 부분만 보여줍니다. 실험실 염색과 취급, 그리고 용량과 노출에 관한 주장의 해석에 미치는 실무적 함의는 여기서 직접 도출됩니다.