Метилен көгін жасушалық тыныс алумен байланыстырған тәжірибелер

37 °C температурада үш сағат ұсталған, фибрині алынған адам қаны құрамындағы оттегінің шамамен екі пайызын тұтынады. Инкубация алдында аз мөлшерде метилен көгін қосса, сол қан оттегінің шамамен алпыс бес пайызын тұтынады. Жасушалардың өзінде ештеңе өзгерген жоқ. Тек ерітінді өзгерді.

Бұл сан Джонс Хопкинс университетіндегі Джордж Харроп пен Э. С. Гусман Барронның 1928 жылғы мақаласынан алынған. Метилен көгі жасушалық тыныс алуды жақсартады деген кең тараған тұжырымның бастауы — осы мақала. Бұл тұжырым жалған емес, бірақ оның мағынасы естілгендегіден тар.

Кестедегі сан шын мәнінде нені өлшейді

Өлшенген соңғы көрсеткіш газ талдауы арқылы анықталған оттегі сіңірілуі болды. Харроп пен Баррон жаңадан алынған қанды лейкоциттерден арылту үшін 10 °C температурада мақта арқылы сүзді, үлгіні оттегімен қанықтырды, бөліктерге бөліп, бір бөлігіне бояғыш қосты, содан кейін инкубациядан соң екеуін де талдады. Лейкоциттер саны бір текше миллиметрге шамамен мыңнан сирек асатын. Оттегіні тұтыну үлгідегі бастапқы оттегі мөлшерінің жоғалған үлесі ретінде берілді.

Олар көмірқышқыл газын да өлшеді, бірақ мұнда әдістің шектеуі байқалды. Фибрині алынған қан инкубацияның алғашқы сағатында зерттеліп отырған реакцияға қатысы жоқ себептермен әр 100 mL-ге екі миллимольге дейін көмірқышқыл газын бөліп шығарды. Сондықтан тұтас қаннан алынған тыныс алу коэффициенттерін пайдалану мүмкін болмады. Тек Локк ерітіндісіндегі жуылған жасушалар ғана түсіндіруге болатын көрсеткіштер берді; бояғыш қосылғанда да, қосылмағанда да олар 0.73 пен 0.80 аралығында болды.

Бұл — ұсақ-түйек емес. Осы мақалалардағы «тыныс алу» жабық ыдыстағы газ алмасуды білдіреді. Оттегіні тұтыну мен пайдалы энергия түзілуінің айырмасы оттегіні тұтыну ATP туралы нені көрсетеді және нені көрсетпейді деген мақалада бөлек қарастырылады.

Жасушалар неғұрлым аз тыныс алса, бояғыштың қосқан үлесі соғұрлым көп болды

Сүтқоректілердің жетілген эритроциттерінде өлшеуге келетін оттегі тұтыну жоқтың қасы. Ал құстардың ядросы бар эритроциттері оттегін тұтынады. Харроп пен Баррон екеуін де зерттеді, әрі осы айырмашылық олардың уәжінің негізін құрады.

Сүтқоректілерден алынған үлгілерде бояғыш оттегі тұтынуын жиырма-елу есе арттырды. Жасушалары онсыз да тыныс алатын қаз қанында ол жылдамдықты ешқашан екі еседен артық арттырмады. Бастапқы тыныс алу деңгейі неғұрлым жоғары болса, бояғыштың қосымша әсері соғұрлым аз болды.

Дәл осындай заңдылық бір түрдің ішінде де байқалды. Нағыз полицитемиясы бар науқастан алынған, құрамында жетілмеген жасушалар болған адам қанының үлгісі бояғышсыз өз оттегінің 11.3 пайызын тұтынды, ал сау донордың жуылған жасушаларында бұл көрсеткіш 2.8 пайыз болды. Бояғыш алғашқы үлгідегі көрсеткішті тек 63.4 пайызға жеткізді: алты есе жеделдетті, ал қалыпты жасушаларда жеделдеу отыз есеге жуық болды. Бояғыш жетілген жасушалардың әрекетін жетілмеген жасушаларға ұқсата түсті; авторлар да оның әсерін осылай сипаттады.

Цианид мұны тоқтатуға тиіс еді

Цианидтің жасушалық тотығуды тоқтататыны белгілі болатын. Харроп пен Баррон оны бояғышпен қатар қосты.

Сиыр қанының нәтижелері осыны айқын көрсетеді. Ештеңе қоспағанда, үш сағат ішінде оттегі мөлшері 22.61 көлемдік пайыздан 22.03-ке түсті. Метилен көгі қосылғанда ол 12.84-ке дейін төмендеді. Метилен көгі мен молярдың бес мыңнан біріне тең концентрациядағы калий цианиді қосылғанда, 12.74-ке түсті. Бояғыштың әсері іс жүзінде өзгермеді.

Сурет: адам эритроциттерінің микрореспирациясын үздіксіз тіркеу. Көрсеткі метилен көгі қосылған сәтті белгілейді. Оған дейін қисық дерлік көлденең, ал одан кейін тұрақты түрде жоғарылайды. Харроп пен Барронның Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928) мақаласынан қайта берілген, PMID 19869478.

Олар бояғыш оттегі тасымалдаушысы ретінде әрекет етіп, «ересек сүтқоректілердің ядросыз эритроциттерінен жоғалып кеткен затты қамтамасыз етеді» деген қорытындыға келді. Екі жылдан кейін Рокфеллер институтындағы Михаэлис пен Саломон бұл келіспеушілікті ұзақ сақталған екі нұсқа түрінде тұжырымдады. Бояғыштың әсері не «бояғыштың кездейсоқ қасиеті», не бояғыш «ағзалардағы әлдебір белгісіз заттың моделі» еді. Бұл екі нұсқаның қайсысы дұрыс екені әлі шешілген жоқ. Өзгергені — қазір жасушаларды әлдеқайда дәлірек сипаттауға болады.

Бауыр сығындысы да дәл осылай әсер етті

Михаэлис пен Саломон мүшелердің суық сумен алынған сығындылары да дәл сондай ынталандыру туғызатынын көрсетті. Ең күшті әсер егеуқұйрық бауырында болды, одан кейін бүйрек, көкбауыр және аталық без тұрды. Мидың, бұлшықеттің және қан сарысуының әсері аз болды немесе мүлде болмады.

Содан кейін олар сығындының әсерін көміртек тотығы қатысында тексерді. 98 пайыз көміртек тотығы мен 2 пайыз оттегі қоспасында сығынды да, бояғыш та туғызған тыныс алу өзгермеді. Дәл сол газ қоспасы ашытқылардың және үй құстарының ядролы эритроциттерінің тыныс алуын шамамен 60–80 пайызға тежеді. Бұл Варбургтің көміртек тотығына сезімтал тыныс алу ферменті туралы сипаттамасына сәйкес келді. Демек, тіндегі анықталмаған зат Варбургтің ферменті емес еді.

Зерттеу барысында бірнеше ықтимал зат жоққа шығарылды. Тотықсызданған глутатион мен цистеин тек өздерінің тотығуына қажет оттегі тұтынуын туғызды. Харден мен Янгтың коферменті де алынып тасталды, өйткені ол бұлшықетте ең көп болса да, бұлшықеттің әсері ең аздардың бірі болды. Бірнеше жыл бұрын атау берілген Кейлиннің цитохромы да осы қайшылыққа тап келді. Ал белсенді зат жасуша ядросынан шығады деген өз жорамалын авторлар тек жорамал деп атады.

Әсер белгілі бір шарттарға тәуелді болды

Жасушалар бүтін болуы керек еді. Дистилденген су немесе қайталап мұздату арқылы туғызылған гемолиз бояғышқа да, сығындыға да жауапты жойды, ал ішінара гемолиз оны өз дәрежесіне сай азайтты.

Қант та қажет болды. Глюкоза, фруктоза және сахароза бояғыш туғызған тыныс алуды қолдады; маннитол қолдамады. Қант болмаған кезде тыныс алу мүлде байқалмады, әрі осы үдерісте бояғыш жасушаларды зақымдайтын сияқты болды. Сондықтан бір немесе екі сағаттан кейін қосылған глюкоза тыныс алуды қалпына келтірмеді. Авторлар бояғыш жасушаға қажет құрылымдық құрамбөлікті тотықтырады деп болжады.

Жарық бояғыштың әсерін едәуір күшейтті, дегенмен әсер қараңғыда да анық байқалды. Басқа тотықсызданатын бояғыштар өзге нәтиже берді: толуилен көгінің әсері метилен көгіне тең немесе одан күшті болды, ал индиго дисульфонаты дерлік әсер етпеді. Бояғыштың тотығу-тотықсыздану потенциалы мен оның әсерінің шамасы арасында айқын байланыс табылмады. Авторлар мұны мембрана өткізгіштігімен және уыттылықпен түсіндірді.

Әсер тыныс алуға емес, ашуға сәйкес келді

Барронның 1930 жылғы зерттеуі жасуша суспензияларынан егеуқұйрықтың қалыпты мүшелері мен трансплантацияланған ісіктердің тін кесінділеріне ауысты.

Аэробтық гликолизі жоқ тіндерде метилен көгі әсер етпеді немесе оттегі тұтынуын аздап бәсеңдетті: бүйректе шамамен 14 пайызға, ұйқыбезде шамамен 14 пайызға, бауырда шамамен 5 пайызға. Оттегі бар ортада ашу жүретін тіндерде ол тұтынуды арттырды: көкбауырда шамамен 8 пайызға, мида шамамен 13 пайызға. Ісіктерде өсім адамның сүт безі карциномасындағы шамамен 27 пайыздан Раус тауық саркомасындағы 80 пайыздан астамға дейін жетті және әр тіннің аэробтық гликолизіне шамамен пропорционал болды.

Сурет: әр нүкте бір тін түрін білдіреді. Көлденең ось — аэробтық гликолиз; тік ось — метилен көгі қосылғаннан кейінгі оттегі тұтынуының өзгерісі. Деректер Барронның Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930) мақаласының 6-кестесінен алынған, PMID 19869777.

Содан кейін цианидпен жүргізілген тәжірибе кері көріністі берді. Бұрын жауап бермеген осы тіндердегі тыныс алу цианидпен бөгеліп, ашу айқын байқалғанда, бояғыш оттегі тұтынуын қайтадан арттырды: бүйректе шамамен 59 пайызға, бауырда шамамен 19 пайызға, көкбауырда шамамен 286 пайызға, аталық безде шамамен 200 пайызға.

Баррон бояғышты жасушаның немесе тіннің ашу қабілетін анықтайтын сынақ ретінде пайдалануға болады деп ұсынды. Мақаласын ол мынадай болжаммен аяқтады: бояғышы бар ортада ісік жасушаларын көптеген ұрпақ бойы өсіру бір күні ісіктің зат алмасуын қалыпты тіндегідей етіп тұрақты өзгертуі мүмкін. Бұл 1930 жылы қойылған зерттеу сұрағы еді. Бұл емдеу туралы тұжырым емес.

Бұл тәжірибелер нені өлшей алмады

1928 және 1930 жылдары «тыныс алу» оттегіні тұтынуды білдіретін. Аденозинтрифосфат туралы алғаш рет 1929 жылы хабарланды, ал оқшауланған митохондриялардың электрондарды тасымалдау кезінде фосфатты этерификациялайтыны 1949 жылы көрсетілді. Метилен көгі туралы алғашқы мақалалардың ешқайсысында энергия өндірілуі өлшенуі мүмкін емес еді, әрі олардың ешқайсысы мұны өлшедік деп мәлімдемеді.

Екінші мәселе — жасушалардың өзі. Сүтқоректілердің жетілген эритроциттерінде митохондриялар болмайды. Ретикулоцит кезеңінде олар митохондриялар мен рибосомаларды таңдамалы аутофагия арқылы жояды. Сондықтан жетілген эритроцит гликолиз есебінен жұмыс істейді, ал оның пентозофосфаттық жолы негізінен ATP үшін емес, NADPH алу үшін қажет. 1928 жылғы тәжірибелерде қалпына келтіретін электрон тасымалдау тізбегі болған жоқ. Оттегіні тұтынған үдеріс басқа қызмет атқарды.

Қазір сол басқа үдеріс біршама жақсы сипатталған. Метилен көгі жасушаның тотықсыздандырғыш эквиваленттерінен электрондарды қабылдап, лейкометилен көгіне айналады. Ол молекулалық оттегімен қайта тотығып, циклді тұйықтайды. Адам эритроциттерінде тотықсыздану сатысын NADPH-тәуелді флавинредуктаза және оған туыстас дисульфидредуктазалар атқарады. Таңбаланған глюкоза пайдаланылған 1976 жылғы зерттеу бояғыштың гексозомонофосфаттық шунтты ынталандыратынын, төмен концентрациядағы әсерінің оксигемоглобинге тәуелді екенін және жоғарырақ, 0.1 mM концентрацияда сутек асқын тотығы түзілетінін анықтады. Тотықсызданған бояғыш оттегімен әрекеттескенде фосфаттық байланыстар емес, пероксид түзіледі.

Митохондрияларда жағдай көпшілікке арналған шолулар мойындайтыннан да даулырақ. Зерттеулердің бір бағыты бояғыш электрондарды I кешен аймағынан алып, цитохром c-ге береді деп есептейді. Басқа зерттеу тышқан миының митохондрияларында ол антимицинмен бөгелген тыныс алуды қалпына келтіре алмайтынын анықтап, электрон акцепторын III кешеннің убихинол байланыстыратын орнына орналастырды. Үшінші зерттеу төмен концентрациялар тыныштық күйіндегі оттегі тұтынуын арттырғанымен, ADP ынталандырған тыныс алуды өзгертпейтінін анықтады. Мәселенің ең тікелей тұжырымы мынадай: метилен көгі туғызған оттегі тұтынуы тотығулық фосфорлануға мүлде тәуелді емес; ол тыныс алу тізбегі тежелгенде де, мұндай тізбегі жоқ препараттарда да сақталды.

Осы екі көрсеткіштің арасындағы алшақтықты тікелей өлшеген зерттеулер де бар. Егеуқұйрық бауырынан оқшауланған митохондрияларда бояғыш концентрациясының артуы тыныс алуды бақылау коэффициенттерін төмендетіп, ісінуге әкелді. Авторлар мұны тотығулық фосфорланудың ажырауы деп сипаттады. Перфузияланған егеуқұйрық бауырында метилен көгі оттегі тұтынуын арттырды, ал ATP-тің ADP-ке қатынасы төмендеді.

Клиникалық деректер де осыны көрсетеді. Метгемоглобинемия NADPH-тәуелді тотықсыздану жолы арқылы дене салмағының әр килограмына шамамен бір-екі миллиграмм метилен көгін көктамыр ішіне енгізумен емделеді, ал үлкенірек дозалар емделіп жатқан жағдайдың өзін туғызады. Сол шолуда у қайтарғыш әсердің бүтін эритроциттерде ең күшті болатыны, ал гемолиз кезінде төмендейтіні атап өтілген. Бұл — 1930 жылғы гемолиз туралы тұжырымның жетпіс үш жылдан кейін аурухана жағдайында қайта көрінуі. Пайдалы және зиянды әсерлері дозалық шектің екі жағында орналасқан қосылыстың дозасын оттегі тұтынуын өлшеу нәтижесінен шығарып анықтауға болмайды.

Неліктен бұл талқылауда партияның маңызы бар

Харроп пен Баррон қайта оқуға тұрарлық бір жайтты байқады. Метилен көгінің өзі спектроскопта метгемоглобинге тән екі жолақтың арасында жолақ түзеді, «бұл үстірт қарағанда оңай шатастыруы мүмкін». Бояғыш ізделіп отырған затқа ұқсап көрінуі мүмкін.

Осы мәселенің химиялық жағы да бар. Аз мөлшердегі құрамбөлік ретінде кездесетін туыстас фенотиазиннің өзіндік тотығу-тотықсыздану қасиеті, өткізгіштігі және уыттылығы болады. Құжатталған бір жағдай мұның маңызын нақты көрсетеді: метилен көгін йодтау зерттеуінде шамамен 7–8 пайыз Azure B бар үлгілер негізінен йодталған Azure B түзген. Яғни реакцияда метилен көгі емес, қоспа басым болған.

Метилен көгін зертханада, бояу жұмыс орнында немесе аквариумда реагент ретінде пайдаланатын кез келген адам, партияның сипаттамалары анықталмаған болса, құрамы нақтыланбаған затпен жұмыс істейді. Туыстас заттар, сәйкестендіру, элементтік қоспалар, қалдық еріткіштер және күйдіргеннен кейінгі қалдық — тәжірибеге қатысты жай қағаздар емес, тәжірибенің бір бөлігі. Blupreme метилен көгін фармацевтикалық өндірушіден алады және тек ауыр металдарды емес, USP спецификациясының барлық талаптарын тексеретін толық талдау сертификатын жариялайды. Талдау сертификатын оқу нұсқаулығы және USP сапа деңгейі нені растайды және нені растамайды деген мақалалар құжатты мәлімделген сипаттамалармен қалай салыстыру керегін түсіндіреді.

Сан дұрыс еді

1928 және 1930 жылдардағы тәжірибелер мұқият жүргізілген, әрі олардың негізгі байқауы әлі де өз күшінде: тотықсызданатын бояғыш тыныс алуы мардымсыз жасушаның оттегіні тыныштық күйіндегі деңгейінен бірнеше есе көп тұтынуына әкелуі мүмкін, әрі бұл үдеріс цианид бөгейтін сатыдан өтпейді.

Қате кейінірек, «тыныс алу» сөзін қазіргі мағынасында түсіндіргенде пайда болады. Газ алмасуды өлшеу электрондардың оттегіге жеткенін көрсетеді. Бірақ олардың қандай да бір бөлігі ATP түзуге пайдаланылғанын көрсетпейді. Митохондриясы жоқ жасушада осы екі тұжырымның арасы барынша алшақ. Метилен көгінің жасушалардағы әсерлерінің кеңірек картасы осы айырмашылықты кең ауқымда қарастырады, ал қосылыстың бояғыштан дәріге дейінгі тарихы тоқыма бояғышының бұл тәжірибелерге қалай жеткенін түсіндіреді.