ექსპერიმენტები, რომლებმაც მეთილენის ლურჯი უჯრედულ სუნთქვას დაუკავშირა

დეფიბრინირებული ადამიანის სისხლი, რომელსაც სამი საათის განმავლობაში 37 °C-ზე აჩერებენ, მასში არსებული ჟანგბადის დაახლოებით ორ პროცენტს მოიხმარს. თუ ინკუბაციამდე მას მცირე რაოდენობით მეთილენის ლურჯს დავუმატებთ, იგივე სისხლი დაახლოებით სამოცდახუთ პროცენტს მოიხმარს. უჯრედებში არაფერი შეცვლილა. შეიცვალა მხოლოდ ხსნარი.

ეს რიცხვი ჯონს ჰოპკინსის უნივერსიტეტში მომუშავე ჯორჯ ჰაროპისა და ე. ს. გუსმან ბარონის 1928 წლის ნაშრომიდან მოდის. სწორედ აქედან იღებს სათავეს ხშირად გამეორებული მტკიცება, რომ მეთილენის ლურჯი უჯრედულ სუნთქვას აუმჯობესებს. ეს მტკიცება მცდარი არ არის, თუმცა უფრო ვიწრო მნიშვნელობა აქვს, ვიდრე ერთი შეხედვით ჩანს.

რას ზომავს სინამდვილეში ცხრილში მოცემული რიცხვი

საბოლოო მაჩვენებელი იყო ჟანგბადის შთანთქმა, რომელსაც აირების ანალიზით განსაზღვრავდნენ. ჰაროპი და ბარონი ახლად აღებულ სისხლს 10 °C-ზე ბამბაში ფილტრავდნენ, რათა თეთრი უჯრედები მოეშორებინათ; ნიმუშს ჟანგბადით აჯერებდნენ, ყოფდნენ, ერთ ნაწილს საღებავს უმატებდნენ და ინკუბაციის შემდეგ ორივეს აანალიზებდნენ. ლეიკოციტების რაოდენობა იშვიათად აღემატებოდა დაახლოებით ათასს კუბურ მილიმეტრზე. ჟანგბადის მოხმარება აღირიცხებოდა როგორც ნიმუშში თავდაპირველად არსებული ჟანგბადის ის წილი, რომელიც გაქრა.

ისინი ნახშირორჟანგსაც ზომავდნენ, თუმცა ამ შემთხვევაში მეთოდი პრობლემას ქმნიდა. ინკუბაციის პირველ საათში დეფიბრინირებული სისხლი ყოველ 100 mL-ზე ორ მილიმოლამდე ნახშირორჟანგს გამოყოფდა იმ მიზეზებით, რომლებიც შესასწავლ რეაქციას არ უკავშირდებოდა. ამიტომ მთლიანი სისხლის სუნთქვითი კოეფიციენტები გამოსაყენებლად უვარგისი იყო. ინტერპრეტირებადი მონაცემები მხოლოდ ლოკის ხსნარში მოთავსებულმა გარეცხილმა უჯრედებმა მისცა; როგორც საღებავით, ისე მის გარეშე, ეს მაჩვენებლები 0.73-სა და 0.80-ს შორის იყრიდა თავს.

ეს უმნიშვნელო წვრილმანი არ არის. ამ ნაშრომებში „სუნთქვა“ დახურულ ჭურჭელში აირთა ცვლას ნიშნავს. ჟანგბადის მოხმარებასა და სასარგებლო ენერგიის გამომუშავებას შორის სხვაობა ცალკეა განხილული სტატიაში რას გვიჩვენებს და რას არ გვიჩვენებს ჟანგბადის მოხმარება ATP-ს შესახებ.

საღებავი ყველაზე მეტს იქ ამატებდა, სადაც უჯრედები ყველაზე ნაკლებად სუნთქავდა

ძუძუმწოვრების მომწიფებულ ერითროციტებში ჟანგბადის მოხმარება გაზომვადი თითქმის არ არის. ფრინველების ბირთვიან ერითროციტებში კი არის. ჰაროპმა და ბარონმა ორივე შეისწავლეს და მათ შორის განსხვავება მათი არგუმენტის საფუძველია.

ძუძუმწოვრების ნიმუშებში საღებავმა ოციდან ორმოცდაათჯერ გაზარდა მაჩვენებელი. ბატის სისხლში, რომლის უჯრედებიც ისედაც სუნთქავდა, სიჩქარე არასოდეს გაზრდილა ორჯერ მეტად. რაც უფრო მაღალი იყო საწყისი სუნთქვა, მით ნაკლების დამატება შეეძლო საღებავს.

იგივე კანონზომიერება ერთი სახეობის ფარგლებშიც ჩანს. ჭეშმარიტი პოლიციტემიის მქონე პაციენტის სისხლის ნიმუში, რომელიც მოუმწიფებელ უჯრედებს შეიცავდა, საღებავის გარეშე ჟანგბადის 11.3 პროცენტს მოიხმარდა, ხოლო ჯანმრთელი დონორის გარეცხილი უჯრედები — 2.8 პროცენტს. საღებავმა მაჩვენებელი მხოლოდ 63.4 პროცენტამდე გაზარდა: აჩქარება ექვსმაგი იყო, მაშინ როცა ნორმალური უჯრედები თითქმის ოცდაათჯერ აჩქარდა. საღებავი მომწიფებულ უჯრედებს მოუმწიფებელი უჯრედების მსგავსი ქცევისკენ უბიძგებდა — სწორედ ასე აღწერდნენ მის მოქმედებას ავტორები.

ციანიდს ეს უნდა შეეჩერებინა

ცნობილი იყო, რომ ციანიდი უჯრედულ ჟანგვას აჩერებდა. ჰაროპმა და ბარონმა ის მაინც დაამატეს, საღებავთან ერთად.

მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვის სისხლის შედეგები ტიპურ სურათს აჩვენებს. ყოველგვარი დანამატის გარეშე ჟანგბადის შემცველობა სამ საათში 22.61-დან 22.03 მოცულობით პროცენტამდე შემცირდა. მეთილენის ლურჯით ის 12.84-მდე დაეცა. მეთილენის ლურჯისა და მოლარის ერთი ხუთიათასედი კონცენტრაციის კალიუმის ციანიდის დამატებისას კი — 12.74-მდე. საღებავის ეფექტი არსებითად უცვლელი დარჩა.

სურათი: ადამიანის ერითროციტების მიკროსუნთქვის უწყვეტი ჩანაწერი. ისარი მეთილენის ლურჯის დამატებას აღნიშნავს. მანამდე მრუდი თითქმის ჰორიზონტალურია, შემდეგ კი თანმიმდევრულად იზრდება. გადმობეჭდილია ჰაროპისა და ბარონის ნაშრომიდან, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

მათ დაასკვნეს, რომ საღებავი ჟანგბადის გადამტანად მოქმედებდა და „აწვდიდა ნივთიერებას, რომელიც ზრდასრული ძუძუმწოვრების უბირთვო ერითროციტებიდან გამქრალია“. ორი წლის შემდეგ როკფელერის ინსტიტუტში მიხაელისმა და სალომონმა უთანხმოება ჩამოაყალიბეს იმ სახით, რომელიც დღემდე დარჩა. ან საღებავის ეფექტი იყო „საღებავის შემთხვევითი თვისება“, ან საღებავი წარმოადგენდა „ორგანიზმებში არსებული რომელიღაც უცნობი ნივთიერების მოდელს“. ამ ორ ვარიანტს შორის არჩევანი ჯერაც არ გაკეთებულა. შეიცვალა ის, რომ დღეს უჯრედების აღწერა გაცილებით ზუსტად შეიძლება.

ღვიძლის ექსტრაქტიც იმავეს აკეთებდა

მიხაელისმა და სალომონმა აჩვენეს, რომ ორგანოების ცივი წყლით მიღებული ექსტრაქტები იმავე სტიმულაციას იწვევს. ყველაზე ძლიერი იყო ვირთხის ღვიძლის ექსტრაქტი, შემდეგ მოდიოდა თირკმელი, ელენთა და სათესლე ჯირკვალი. თავის ტვინს, კუნთსა და სისხლის შრატს მცირე ეფექტი ჰქონდა ან საერთოდ არ ჰქონდა.

შემდეგ მათ ექსტრაქტი ნახშირბადის მონოქსიდის პირობებში გამოცადეს. როგორც ექსტრაქტით, ისე საღებავით გამოწვეული სუნთქვა უცვლელი რჩებოდა ნარევში, რომელიც 98 პროცენტ ნახშირბადის მონოქსიდსა და 2 პროცენტ ჟანგბადს შეიცავდა. იგივე აირთა ნარევი საფუარისა და შინაური ფრინველების ბირთვიანი ერითროციტების სუნთქვას დაახლოებით 60-დან 80 პროცენტამდე თრგუნავდა, რაც შეესაბამებოდა ვარბურგის აღწერას ნახშირბადის მონოქსიდის მიმართ მგრძნობიარე სუნთქვითი ფერმენტის შესახებ. ამრიგად, ქსოვილში არსებული დაუდგენელი ნივთიერება ვარბურგის ფერმენტი არ იყო.

კვლევის პროცესში რამდენიმე სავარაუდო კანდიდატი გამოირიცხა. აღდგენილი გლუტათიონი და ცისტეინი მხოლოდ იმდენ ჟანგბადს მოიხმარდა, რამდენიც მათივე დაჟანგვას სჭირდებოდა. ჰარდენისა და იანგის კოენზიმი გამოირიცხა, რადგან ის ყველაზე დიდი რაოდენობით კუნთშია, კუნთმა კი თითქმის ყველაზე მცირე ეფექტი აჩვენა. რამდენიმე წლით ადრე სახელდებულ კეილინის ციტოქრომსაც იგივე წინააღმდეგობა შეხვდა. საკუთარ ვარაუდს, რომ აქტიური ნივთიერება უჯრედის ბირთვიდან მოდიოდა, ავტორებმა მხოლოდ ვარაუდი უწოდეს.

ეფექტს გარკვეული პირობები სჭირდებოდა

უჯრედები დაუზიანებელი უნდა ყოფილიყო. გამოხდილი წყლით ან განმეორებითი გაყინვით გამოწვეული ჰემოლიზი როგორც საღებავზე, ისე ექსტრაქტზე რეაქციას აქრობდა, ნაწილობრივი ჰემოლიზი კი მას პროპორციულად ამცირებდა.

შაქარიც აუცილებელი იყო. გლუკოზა, ფრუქტოზა და საქაროზა საღებავით გამოწვეულ სუნთქვას ხელს უწყობდა; მანიტოლი — არა. შაქრის გარეშე სუნთქვა საერთოდ არ ხდებოდა და, როგორც ჩანდა, ამ პროცესში საღებავი უჯრედებს აზიანებდა. ამიტომ ერთი ან ორი საათის შემდეგ დამატებული გლუკოზა სუნთქვას ვეღარ აღადგენდა. ავტორები ვარაუდობდნენ, რომ საღებავი უჯრედისთვის აუცილებელ სტრუქტურულ კომპონენტს ჟანგავდა.

განათება საღებავის ეფექტს მნიშვნელოვნად ზრდიდა, თუმცა ეფექტი სიბნელეშიც აშკარა იყო. სხვა აღდგენადი საღებავები განსხვავებულად იქცეოდა: ტოლუილენის ლურჯი მეთილენის ლურჯს უტოლდებოდა ან აღემატებოდა, ხოლო ინდიგოს დისულფონატი თითქმის არაფერს აკეთებდა. საღებავის ჟანგვა-აღდგენით პოტენციალსა და მისი ეფექტის სიდიდეს შორის მკაფიო კავშირი არ გამოვლენილა; ავტორები ამას მემბრანის განვლადობასა და ტოქსიკურობას უკავშირებდნენ.

ეფექტი დუღილს მიჰყვებოდა და არა სუნთქვას

1930 წლის კვლევაში ბარონმა უჯრედული სუსპენზიებიდან ვირთხის ნორმალური ორგანოებისა და გადანერგილი სიმსივნეების ქსოვილის ანათლებზე გადაინაცვლა.

ქსოვილებში, რომლებსაც აერობული გლიკოლიზი არ ახასიათებდა, მეთილენის ლურჯი არაფერს ცვლიდა ან ჟანგბადის მოხმარებას ოდნავ თრგუნავდა: თირკმელში დაახლოებით 14 პროცენტით, კუჭქვეშა ჯირკვალში დაახლოებით 14 პროცენტით, ღვიძლში დაახლოებით 5 პროცენტით. ქსოვილებში, რომლებშიც დუღილი ჟანგბადის არსებობის პირობებშიც მიმდინარეობს, ის მოხმარებას ზრდიდა: ელენთაში დაახლოებით 8 პროცენტით, თავის ტვინში დაახლოებით 13 პროცენტით. სიმსივნეებში ზრდა მერყეობდა ადამიანის ძუძუს კარცინომაში დაახლოებით 27 პროცენტიდან რაუსის ქათმის სარკომაში 80 პროცენტზე მეტამდე და დაახლოებით თითოეული ქსოვილის აერობული გლიკოლიზის პროპორციული იყო.

სურათი: თითოეული წერტილი ქსოვილის ერთ ტიპს წარმოადგენს. ჰორიზონტალურ ღერძზე აერობული გლიკოლიზია, ვერტიკალურზე — მეთილენის ლურჯის დამატების შემდეგ ჟანგბადის მოხმარების ცვლილება. მონაცემები ბარონის ნაშრომიდან, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), ცხრილი 6, PMID 19869777.

შემდეგ ციანიდის ექსპერიმენტმა საპირისპირო სურათი აჩვენა. როდესაც მანამდე არარეაგირებად ქსოვილებში სუნთქვა ციანიდით დაიბლოკა და დუღილი გამოვლინდა, საღებავმა ჟანგბადის მოხმარება კვლავ გაზარდა: თირკმელში დაახლოებით 59 პროცენტით, ღვიძლში დაახლოებით 19 პროცენტით, ელენთაში დაახლოებით 286 პროცენტით, სათესლე ჯირკვალში დაახლოებით 200 პროცენტით.

ბარონმა წამოაყენა მოსაზრება, რომ საღებავი შეიძლება უჯრედის ან ქსოვილის დუღილის უნარის შესამოწმებელ საშუალებად გამოდგეს. ბოლოს კი ვარაუდი გამოთქვა: საღებავის შემცველ გარემოში სიმსივნური კულტურის მრავალი თაობის გამოზრდამ შესაძლოა ერთ დღეს სიმსივნის მეტაბოლიზმი მუდმივად დაამსგავსოს ნორმალური ქსოვილის მეტაბოლიზმს. ეს იყო 1930 წელს დასმული კვლევითი კითხვა. ეს მკურნალობის შესახებ მტკიცება არ არის.

რას ვერ გაზომავდა ეს ექსპერიმენტები

1928 და 1930 წლებში „სუნთქვა“ ჟანგბადის მოხმარებას ნიშნავდა. ადენოზინტრიფოსფატის შესახებ პირველად 1929 წელს გამოქვეყნდა ინფორმაცია, ხოლო იმის ჩვენება, რომ იზოლირებული მიტოქონდრიები ელექტრონების გადატანისას ფოსფატს ესტერიფიცირებს, 1949 წელს მოხდა. მეთილენის ლურჯის შესახებ ვერცერთი ადრეული ნაშრომი ვერ გაზომავდა ენერგიის წარმოქმნას და არცერთი მათგანი ამას არ ამტკიცებდა.

მეორე პრობლემა თავად უჯრედებია. ძუძუმწოვრების მომწიფებული ერითროციტები მიტოქონდრიებს არ შეიცავს. რეტიკულოციტის სტადიაზე ისინი მიტოქონდრიებსა და რიბოსომებს შერჩევითი აუტოფაგიით იშორებენ. ამიტომ მომწიფებული წითელი უჯრედი გლიკოლიზის ხარჯზე მუშაობს, ხოლო პენტოზოფოსფატურ გზაზე ძირითადად NADPH-ისთვისაა დამოკიდებული და არა ATP-სთვის. 1928 წლის ექსპერიმენტებში ელექტრონების ტრანსპორტის ჯაჭვი, რომლის აღდგენაც შეიძლებოდა, საერთოდ არ არსებობდა. რაც ჟანგბადს მოიხმარდა, სხვა რამეს აკეთებდა.

დღეს ეს სხვა პროცესი საკმაოდ კარგადაა აღწერილი. მეთილენის ლურჯი უჯრედული აღმდგენი ეკვივალენტებისგან ელექტრონებს იღებს და ლეიკომეთილენის ლურჯად იქცევა, რომელსაც მოლეკულური ჟანგბადი კვლავ ჟანგავს და ციკლი იკვრება. ადამიანის წითელ უჯრედებში აღდგენის საფეხურს NADPH-ზე დამოკიდებული ფლავინრედუქტაზა და მონათესავე დისულფიდრედუქტაზები ასრულებს. 1976 წლის კვლევამ, რომელშიც მონიშნული გლუკოზა გამოიყენეს, აჩვენა, რომ საღებავი ჰექსოზამონოფოსფატურ შუნტს ასტიმულირებს, დაბალ კონცენტრაციაზე ეფექტი ოქსიჰემოგლობინზე იყო დამოკიდებული, ხოლო უფრო მაღალი კონცენტრაცია, 0.1 mM, წყალბადის ზეჟანგს წარმოქმნიდა. აღდგენილი საღებავის ჟანგბადთან ურთიერთქმედება ზეჟანგს წარმოქმნის და არა ფოსფატურ ბმებს.

მიტოქონდრიებში სურათი უფრო სადავოა, ვიდრე ამას პოპულარული მიმოხილვები აღიარებს. კვლევების ერთი მიმართულების თანახმად, საღებავი ელექტრონებს I კომპლექსის არიდან იღებს და ციტოქრომ c-ს გადასცემს. სხვა კვლევამ აჩვენა, რომ თაგვის თავის ტვინის მიტოქონდრიებში მას ანტიმიცინით ბლოკადის შემდეგ სუნთქვის აღდგენა არ შეუძლია; ელექტრონების მიმღები უბანი კი III კომპლექსის უბიქინოლთან შეკავშირების ადგილზე მიუთითა. მესამე კვლევამ აჩვენა, რომ დაბალი კონცენტრაციები მოსვენების მდგომარეობაში ჟანგბადის მოხმარებას ზრდიდა, ხოლო ADP-ით სტიმულირებულ სუნთქვას უცვლელს ტოვებდა. ამ საკითხის ყველაზე პირდაპირი ფორმულირება ასეთია: მეთილენის ლურჯით გამოწვეული ჟანგბადის მოხმარება საერთოდ არ არის დამოკიდებული ჟანგვით ფოსფორილირებაზე — ის ნარჩუნდებოდა როგორც სუნთქვითი ჯაჭვის დათრგუნვისას, ისე ისეთ პრეპარატებში, სადაც ეს ჯაჭვი არ არსებობდა.

ამ ორ სიდიდეს შორის სხვაობის პირდაპირი გაზომვებიც არსებობს. ვირთხის ღვიძლის იზოლირებულ მიტოქონდრიებში საღებავის მზარდი კონცენტრაციები სუნთქვითი კონტროლის კოეფიციენტებს ამცირებდა და შეშუპებას იწვევდა. ავტორებმა ეს აღწერეს როგორც ჟანგვითი ფოსფორილირების განწყვილება. ვირთხის პერფუზირებულ ღვიძლში მეთილენის ლურჯი ჟანგბადის მოხმარებას ზრდიდა, მაშინ როცა ATP-ისა და ADP-ის თანაფარდობა მცირდებოდა.

კლინიკური მონაცემებიც იმავე გზავნილს ატარებს. მეტჰემოგლობინემიას მკურნალობენ მეთილენის ლურჯის დაახლოებით ერთი-ორი მილიგრამით კილოგრამზე, ინტრავენურად, NADPH-ზე დამოკიდებული აღდგენის გზის მეშვეობით, ხოლო უფრო დიდი დოზები თავად იწვევს იმ მდგომარეობას, რომელსაც მკურნალობენ. იმავე მიმოხილვაში აღნიშნულია, რომ ანტიდოტური ეფექტი ყველაზე ძლიერია დაუზიანებელ ერითროციტებში და ჰემოლიზის არსებობისას მცირდება. ეს 1930 წლის ჰემოლიზის შესახებ მიგნებაა, რომელიც სამოცდაცამეტი წლის შემდეგ საავადმყოფოს კონტექსტში ხელახლა გამოჩნდა. ნაერთის დოზა, რომლის სასარგებლო და საზიანო ეფექტებსაც დოზური ზღვარი ჰყოფს, ჟანგბადის მოხმარების გაზომვიდან არ უნდა განისაზღვროს.

რატომ უნდა განვიხილოთ პარტიაც

ჰაროპმა და ბარონმა შენიშნეს რამ, რაც ხელახლა წაკითხვას იმსახურებს. თავად მეთილენის ლურჯი სპექტროსკოპში წარმოქმნის ზოლს მეტჰემოგლობინის ორ დამახასიათებელ ზოლს შორის, „რამაც ზედაპირული დათვალიერებისას ადვილად შეიძლება დაბნეულობა გამოიწვიოს“. საღებავს შეუძლია იმ ნივთიერების იმიტაცია, რომელსაც ეძებენ.

იმავე პრობლემას ქიმიური ფორმაც აქვს. მცირე შემადგენელი კომპონენტის სახით არსებული მონათესავე ფენოთიაზინი საკუთარი ჟანგვა-აღდგენითი ქცევით, განვლადობითა და ტოქსიკურობით გამოირჩევა. ერთი დოკუმენტირებული შემთხვევა ნათლად აჩვენებს, რა მნიშვნელობა აქვს ამას: მეთილენის ლურჯის იოდირების კვლევაში ნიმუშები, რომლებიც დაახლოებით 7-დან 8 პროცენტამდე Azure B-ს შეიცავდა, ძირითადად იოდირებულ Azure B-ს წარმოქმნიდა. ამრიგად, რეაქციაში დომინირებდა მინარევი და არა მეთილენის ლურჯი.

ვინც მეთილენის ლურჯს რეაგენტად იყენებს — ლაბორატორიაში, შეღებვის სამუშაო მაგიდასთან თუ აკვარიუმში — დაუზუსტებელი შემადგენლობის მასალასთან მუშაობს, თუ პარტიის მახასიათებლები დადგენილი არ არის. მონათესავე ნივთიერებები, იდენტობა, ელემენტური მინარევები, ნარჩენი გამხსნელები და გახურების შემდეგ დარჩენილი ნაშთი ექსპერიმენტის ნაწილია და არა მის გარშემო არსებული საბუთები. Blupreme მეთილენის ლურჯს ფარმაცევტული მწარმოებლისგან იღებს და აქვეყნებს ანალიზის სრულ სერტიფიკატს; შემოწმება მოიცავს მთლიან USP სპეციფიკაციას და არა მხოლოდ მძიმე ლითონებს. ანალიზის სერტიფიკატის წაკითხვის გზამკვლევი და სტატია რას ადასტურებს და რას არ ადასტურებს USP ხარისხის აღნიშვნა განმარტავს, როგორ შევადაროთ დოკუმენტი განცხადებულ მახასიათებლებს.

რიცხვი სწორი იყო

1928 და 1930 წლების ექსპერიმენტები გულდასმით ჩატარდა და მათი მთავარი დაკვირვება დღემდე ძალაშია: აღდგენად საღებავს შეუძლია თითქმის უსუნთქავ უჯრედს ჟანგბადი მოსვენების მდგომარეობასთან შედარებით მრავალჯერ მეტი სიჩქარით მოახმაროს ისე, რომ არ გაიაროს ის საფეხური, რომელსაც ციანიდი ბლოკავს.

შეცდომა მოგვიანებით ჩნდება, როდესაც „სუნთქვას“ თანამედროვე მნიშვნელობით კითხულობენ. აირთა ცვლის გაზომვა გვიჩვენებს, რომ ელექტრონებმა ჟანგბადამდე მიაღწია. ის არ გვიჩვენებს, გამოიყენეს თუ არა რომელიმე მათგანი ATP-ის წარმოსაქმნელად, ხოლო მიტოქონდრიების არმქონე უჯრედში ამ ორ მტკიცებას შორის სხვაობა მაქსიმალურად დიდია. უფრო ფართო სურათი იმისა, თუ რას აკეთებს მეთილენის ლურჯი უჯრედებში იმავე განსხვავებას უფრო ფართო კონტექსტში ათავსებს, ხოლო ნაერთის ისტორია საღებავიდან მედიცინამდე ხსნის, როგორ მოხვდა ტექსტილის საღებავი თავდაპირველად ამ ექსპერიმენტებში.