Eksperimen sing nggayutake biru metilena karo respirasi seluler

Getih manungsa sing wis dibusak fibrine, dipanasake nganti 37 °C suwene telung jam, ngonsumsi watara rong persen oksigen sing ana ing njero. Yen ditambahake biru metilena sithik sadurunge inkubasi, getih sing padha ngonsumsi watara sewidak lima persen. Ora ana owah-owahan ing sel kasebut. Mung larutane sing owah.

Angka kasebut asale saka makalah taun 1928 dening George Harrop lan E. S. Guzman Barron ing Johns Hopkins, lan dadi dhasar pratelan sing kerep dibaleni yen biru metilena ningkatake respirasi seluler. Pratelan kasebut ora salah, nanging cakupane luwih winates tinimbang kesan sing ditimbulake.

Apa sing sejatine diukur dening angka ing tabel

Parameter asil sing diukur yaiku penyerapan oksigen, sing ditemtokake kanthi analisis gas. Harrop lan Barron nyaring getih sing lagi dijupuk liwat kapas ing suhu 10 °C kanggo nyingkirake sel getih putih, njenuhake sampel nganggo oksigen, mbagi sampel kasebut, nambahake zat pewarna menyang salah siji bagean, banjur nganalisis loro-lorone sawise inkubasi. Cacah leukosit arang ngluwihi watara sewu saben milimeter kubik. Konsumsi oksigen dilapurake minangka bagean saka kandhutan oksigen wiwitan sampel sing wis ilang.

Dheweke uga ngukur karbon dioksida, nanging kanggo pangukuran iki metode kasebut nemoni kendala. Getih sing wis dibusak fibrine ngeculake nganti rong milimol karbon dioksida saben 100 mL ing jam pisanan inkubasi amarga sebab sing ora ana gayutane karo reaksi sing ditliti, mula kuosien respirasi saka getih wutuh ora bisa digunakake. Mung sel sing wis dikumbah lan dilebokake ing larutan Locke sing menehi angka sing bisa ditafsirake, lan angka kasebut nglumpuk ing antarane 0.73 lan 0.80, nganggo utawa tanpa zat pewarna.

Rincian kasebut dudu perkara sepele. Ing makalah-makalah iki, "respirasi" ateges ijol-ijolan gas ing wadhah katutup. Bedane konsumsi oksigen lan energi migunani sing diasilake dirembug kanthi kapisah ing apa sing bisa lan ora bisa dicritakake dening konsumsi oksigen babagan ATP.

Zat pewarna menehi tambahan paling gedhe ing sel sing respirasine paling sithik

Eritrosit mamalia sing wis diwasa meh ora duwe konsumsi oksigen sing bisa diukur. Eritrosit manuk sing duwe inti sel duwe konsumsi oksigen. Harrop lan Barron nguji loro-lorone, lan bedane dadi dhasar utama argumentasine.

Ing sampel mamalia, zat pewarna ngasilake paningkatan ping rong puluh nganti seket. Ing getih banyak, sing sele wis nindakake respirasi, laju kasebut ora tau mundhak luwih saka ping pindho. Saya dhuwur respirasi wiwitane, saya sithik tambahan sing bisa diwenehake zat pewarna.

Pola sing padha uga katon ing siji spesies. Sampel manungsa saka pasien kanthi polisitemia vera, sing ngemot sel durung diwasa, ngonsumsi 11.3 persen oksigene tanpa zat pewarna, dibandhingake karo 2.8 persen ing sel sing wis dikumbah saka donor sehat. Zat pewarna mung nambah angka kasebut nganti 63.4 persen, sawijining paningkatan ping enem, dene ing sel normal paningkatane meh ping telung puluh. Zat pewarna ndadekake sel diwasa tumindak luwih kaya sel durung diwasa, kaya sing diandharake para panulis.

Sianida kudune ngendhegake proses kasebut

Sianida wis dikenal bisa ngendhegake oksidasi seluler. Harrop lan Barron tetep nambahake sianida bebarengan karo zat pewarna.

Asil saka getih sapi nggambarake pola kasebut. Tanpa tambahan apa-apa, kandhutan oksigen mudhun saka 22.61 dadi 22.03 persen volume sajrone telung jam. Kanthi biru metilena, kandhutan kasebut mudhun dadi 12.84. Kanthi biru metilena lan kalium sianida kanthi konsentrasi sapralima ewu molar, kandhutan kasebut mudhun dadi 12.74. Efek zat pewarna praktis ora kena pengaruh.

Gambar: rekaman mikrorespirasi eritrosit manungsa kanthi terus-terusan. Panah nuduhake wektu biru metilena ditambahake. Sadurunge, garis rekaman meh rata; sawise iku, garis kasebut mundhak kanthi ajeg. Direproduksi saka Harrop lan Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Dudutane yaiku zat pewarna tumindak minangka pembawa oksigen, "nyedhiyakake zat sing wis ilang saka eritrosit mamalia diwasa sing ora duwe inti sel." Rong taun sabanjure, Michaelis lan Salomon ing Rockefeller Institute ngrumusake prabédan panemu kasebut ing wangun sing tetep dadi pitakon nganti saiki. Efek zat pewarna iku bisa dadi "sipat zat pewarna sing mung kebeneran ana," utawa zat pewarna iku "model kanggo sawijining zat sing durung dikenal ing organisme." Rong kemungkinan kasebut durung dipesthekake. Sing wis owah yaiku saiki sel kasebut bisa diterangake kanthi luwih tliti.

Ekstrak ati menehi efek sing padha

Michaelis lan Salomon nuduhake yen ekstrak organ sing digawe nganggo banyu adhem ngasilake stimulasi sing padha. Ati tikus menehi efek paling kuwat, disusul ginjel, limpa, lan testis. Otak, otot, lan serum getih menehi efek sithik utawa ora menehi efek babar pisan.

Banjur dheweke nguji ekstrak kasebut marang karbon monoksida. Respirasi sing dipicu ekstrak utawa zat pewarna ora owah ing campuran 98 persen karbon monoksida lan 2 persen oksigen. Campuran gas sing padha nyandhet respirasi ragi lan eritrosit unggas sing duwe inti sel watara 60 nganti 80 persen, cocog karo andharane Warburg babagan enzim respirasi sing peka marang karbon monoksida. Mula, zat jaringan sing durung diidentifikasi kasebut dudu enzime Warburg.

Sawetara calon zat disingkirake sajrone panaliten. Glutation tereduksi lan sistein mung ngasilake konsumsi oksigen sing dibutuhake kanggo oksidasine dhewe. Koenzime Harden lan Young disingkirake amarga otot ngemot koenzim kasebut paling akeh, nanging nuduhake efek sing meh paling sithik. Sitokrome Keilin, sing dijenengi sawetara taun sadurunge, uga nemoni pertentangan sing padha. Panemune dhewe, yen zat aktif kasebut asale saka inti sel, diarani mung sawijining usulan.

Efek kasebut mbutuhake syarat tartamtu

Sel kudu tetep wutuh. Hemolisis amarga banyu suling utawa pembekuan bola-bali ngilangi tanggapan marang zat pewarna lan ekstrak, lan hemolisis sebagean nyuda tanggapan kasebut kanthi proporsional.

Gula uga dibutuhake. Glukosa, fruktosa, lan sukrosa nyengkuyung respirasi sing dipicu zat pewarna; manitol ora. Tanpa gula, ora ana respirasi babar pisan, lan zat pewarna katon ngrusak sel sajrone proses kasebut, mula glukosa sing ditambahake siji utawa rong jam sabanjure ora bisa mulihake respirasi. Para panulis ngusulake yen zat pewarna ngoksidasi sawijining komponen struktural sing dibutuhake sel.

Cahya nambah efek zat pewarna kanthi gedhe, sanajan efek kasebut tetep cetha ing peteng. Zat pewarna liyane sing bisa direduksi nuduhake tumindak sing beda: biru toluilena padha karo utawa ngluwihi biru metilena, dene indigo disulfonat meh ora menehi efek. Ora ditemokake gayutan sing cetha antarane potensial oksidasi-reduksi zat pewarna lan gedhene efek kasebut, sing miturut para panulis disebabake dening permeabilitas membran lan toksisitas.

Efek kasebut manut fermentasi, dudu respirasi

Panalitene Barron taun 1930 pindhah saka suspensi sel menyang irisan jaringan organ tikus normal lan tumor sing ditransplantasi.

Ing jaringan tanpa glikolisis aerobik, biru metilena ora menehi efek utawa rada nyuda konsumsi oksigen: ginjel watara 14 persen, pankreas watara 14 persen, lan ati watara 5 persen. Ing jaringan sing nindakake fermentasi nalika ana oksigen, zat kasebut nambah konsumsi: limpa watara 8 persen lan otak watara 13 persen. Paningkatan ing tumor wiwit saka watara 27 persen ing karsinoma payudara manungsa nganti luwih saka 80 persen ing sarkoma Rous ing pitik, kira-kira proporsional karo glikolisis aerobik saben jaringan.

Gambar: saben titik makili siji jinis jaringan. Sumbu horizontal yaiku glikolisis aerobik; sumbu vertikal yaiku owah-owahan konsumsi oksigen sawise diwenehi biru metilena. Data saka Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabel 6, PMID 19869777.

Eksperimen sianida banjur ngasilake pola kosok baline. Nalika respirasi ing jaringan sing sadurunge ora nanggapi kasebut disandhet nganggo sianida lan fermentasi dadi katon, zat pewarna nambah konsumsi oksigen maneh: ginjel watara 59 persen, ati watara 19 persen, limpa watara 286 persen, lan testis watara 200 persen.

Barron ngusulake yen zat pewarna bisa digunakake minangka tes kemampuan fermentasi sel utawa jaringan, banjur mungkasi makalah kanthi spekulasi: kultur tumor sajrone pirang-pirang generasi ing medium sing ngemot zat pewarna bisa uga sawijining dina ndadekake metabolisme tumor kanthi permanen kaya jaringan normal. Kuwi pitakon panaliten sing ditulis ing taun 1930. Kuwi dudu pratelan babagan pangobatan.

Apa sing ora bisa diukur dening eksperimen kasebut

Ing taun 1928 lan 1930, "respirasi" ateges konsumsi oksigen. Adenosin trifosfat pisanan dilapurake ing taun 1929, lan bukti yen mitokondria sing diisolasi ngesterifikasi fosfat nalika mindhah elektron lagi dituduhake ing taun 1949. Ora ana makalah awal babagan biru metilena sing bisa ngukur produksi energi, lan ora ana sing ngaku wis ngukur.

Sel kasebut dadi masalah kapindho. Eritrosit mamalia diwasa ora ngemot mitokondria. Sajrone tahap retikulosit, sel kasebut nyingkirake mitokondria lan ribosom liwat autofagi selektif. Mula, sel getih abang diwasa nggunakake glikolisis kanggo nyukupi kabutuhan energi lan gumantung marang jalur pentosa fosfat utamane kanggo NADPH tinimbang ATP. Ing eksperimen taun 1928, ora ana rantai transpor elektron sing bisa didandani. Proses apa wae sing ngonsumsi oksigen kasebut nindakake fungsi liyane.

Saiki, proses liyane kasebut wis bisa diterangake kanthi cukup cetha. Biru metilena nampa elektron saka ekuivalen pereduksi seluler lan dadi leukometilena biru, sing banjur dioksidasi maneh dening oksigen molekuler, saengga sikluse rampung. Ing sel getih abang manungsa, flavin reduktase sing gumantung marang NADPH lan disulfida reduktase sing gegandhengan nindakake tahap reduksi kasebut. Panaliten taun 1976 sing nggunakake glukosa kanthi label nemokake yen zat pewarna ngrangsang jalur heksosa monofosfat, yen efek ing konsentrasi kurang gumantung marang oksihemoglobin, lan yen konsentrasi luwih dhuwur, 0.1 mM, ngasilake hidrogen peroksida. Zat pewarna tereduksi sing ketemu oksigen ngasilake peroksida, dudu ikatan fosfat.

Ing mitokondria, kahanane luwih akeh dipadoni tinimbang sing diakoni ringkesan populer. Sawijining alur panaliten nganggep yen zat pewarna njupuk elektron saka wilayah kompleks I lan menehi elektron kasebut menyang sitokrom c. Panaliten liyane nemokake yen ing mitokondria otak mencit, zat kasebut ora bisa mulihake respirasi sawise disandhet nganggo antimisin, lan malah nemtokake panggonan panampa elektron ing situs pengikatan ubikuinol ing kompleks III. Panaliten katelu nemokake yen konsentrasi kurang nambah konsumsi oksigen nalika ngaso, nanging ora ngowahi respirasi sing dirangsang ADP. Pratelan sing paling langsung babagan perkara iki yaiku konsumsi oksigen sing dipicu biru metilena ora gumantung marang fosforilasi oksidatif babar pisan: konsumsi kasebut tetep ana nalika rantai respirasi disandhet, lan ing preparat sing ora duwe rantai kasebut.

Pangukuran langsung babagan bedane rong besaran kasebut uga ana. Ing mitokondria ati tikus sing diisolasi, paningkatan konsentrasi zat pewarna nyuda rasio kontrol respirasi lan nyebabake pambengkakan, sing diterangake para panulis minangka pamisahan gandhengan ing fosforilasi oksidatif. Ing ati tikus sing dip erfusi, biru metilena nambah konsumsi oksigen, dene rasio ATP marang ADP mudhun.

Cathetan klinis nuduhake pesen sing padha. Methemoglobinemia diobati nganggo watara siji nganti rong miligram biru metilena saben kilogram kanthi intravena, liwat jalur reduksi sing gumantung marang NADPH, lan dosis sing luwih gedhe nyebabake kondisi sing lagi diobati kasebut. Tinjauan sing padha nyathet yen efek minangka antidot paling gedhe ana ing eritrosit sing wutuh lan suda nalika ana hemolisis. Iki minangka temuan hemolisis taun 1930 sing katon maneh pitung puluh telung taun sabanjure ing konteks rumah sakit. Senyawa sing efek migunani lan efek mbebayanine ana ing sisih sing beda saka ambang dosis dudu senyawa sing dosise bisa ditemtokake saka pangukuran konsumsi oksigen.

Ngapa bets kudu dilebokake ing rembugan iki

Harrop lan Barron nyathet sawijining perkara sing perlu diwaca maneh. Biru metilena dhewe ngasilake pita ing spektroskop ing antarane rong pita khas methemoglobin, "sing bisa gampang nyebabake kebingungan nalika dipriksa kanthi sepintas." Zat pewarna bisa niru zat sing lagi digoleki.

Masalah sing padha uga ana ing wujud kimia. Fenotiazin sing gegandhengan lan ana minangka komponen minor duwe prilaku redoks, permeabilitas, lan toksisitas dhewe. Siji kasus sing didokumentasikake nuduhake akibat nyata: ing panaliten iodinasi biru metilena, sampel sing ngemot watara 7 nganti 8 persen Azure B utamane ngasilake Azure B sing wis diiodinasi, mula pangotor kasebut, tinimbang biru metilena, sing ndominasi reaksi.

Sapa wae sing nggunakake biru metilena minangka reagen, ing laboratorium, ing meja pewarnaan, utawa ing akuarium, nggunakake bahan sing durung ditemtokake kanthi cetha kajaba betse wis dikarakterisasi. Zat sing gegandhengan, identitas, pangotor unsur, pelarut sisa, lan residu sawise pemijaran minangka bagean saka eksperimen, dudu mung dokumen pelengkap. Blupreme njupuk biru metilena saka produsen farmasi lan nerbitake sertifikat analisis lengkap, kanthi nguji kabeh spesifikasi USP tinimbang mung logam abot; pandhuan maca sertifikat analisis lan apa sing bisa lan ora bisa dipesthekake dening sebutan kelas USP nerangake carane mriksa kecocokan dokumen karo pratelane.

Angkane pancen bener

Eksperimen taun 1928 lan 1930 ditindakake kanthi tliti, lan pengamatan utamane tetep sah: zat pewarna sing bisa direduksi bisa ndadekake sel sing meh ora nindakake respirasi ngonsumsi oksigen kanthi laju ping pirang-pirang saka laju nalika ngaso, tanpa liwat tahap sing disandhet sianida.

Kesalahane muncul mengko, nalika "respirasi" diwaca nganggo teges modern. Pangukuran ijol-ijolan gas nuduhake yen elektron wis tekan oksigen. Pangukuran kasebut ora nuduhake yen ana elektron kasebut sing digunakake kanggo nggawe ATP, lan ing sel tanpa mitokondria, jarak antarane rong pratelan kasebut amba banget. Peta sing luwih jembar babagan apa sing ditindakake biru metilena ing sel nyelehake prabédan sing padha ing kerangka sing luwih jembar, lan sejarah senyawa kasebut saka zat pewarna nganti obat nerangake carane zat pewarna tekstil bisa mlebu ing eksperimen kasebut wiwitane.