Interpretare l'aspetto delle colonie di E. coli e di altri microrganismi su agar EMB

Uno studente semina per striscio un microrganismo sconosciuto su agar eosina-blu di metilene, lo incuba per una notte e torna a osservare una piastra con colonie scure dai riflessi verdi. Nel quaderno annota «E. coli, confermato». Questa annotazione afferma più di quanto la piastra possa dimostrare. La piastra mostra un fenotipo di crescita e fermentazione in condizioni specifiche. L'identificazione della specie è un'affermazione distinta, che richiede prove separate.

Questa guida affronta i risultati su agar EMB come un esercizio di interpretazione. Spiega il principio di base, presenta un atlante illustrativo delle piastre con i relativi controlli e indica i casi in cui l'immagine da manuale può trarre in inganno.

Il principio alla base della piastra

L'agar EMB è sia selettivo sia differenziale. I coloranti eosina Y e blu di metilene inibiscono molti microrganismi Gram positivi, quindi il terreno favorisce la crescita dei Gram negativi. Gli stessi coloranti fungono da indicatori: quando un microrganismo fermenta lo zucchero disponibile e produce localmente una quantità sufficiente di acido, la colonia incorpora abbondantemente il colorante e assume una colorazione dal viola scuro al blu-nero. In presenza di un'intensa produzione di acido, la superficie della colonia può mostrare un'iridescenza verde metallica. Il protocollo ASM per le piastre di agar eosina-blu di metilene descrive questa combinazione di selezione e differenziazione e fornisce fotografie di riferimento per la didattica.

Prima di interpretare qualsiasi risultato, è importante un dettaglio: verificare quale formulazione si sta usando. La formulazione più antica, Holt Harris Teague, contiene lattosio e saccarosio, mentre l'EMB di Levine contiene solo lattosio. Un microrganismo che fermenta il saccarosio ma non il lattosio, come molti isolati di Serratia marcescens, può avere un aspetto diverso sulle due versioni. La documentazione del produttore sui terreni EMB indica esplicitamente questa differenza di formulazione. Annotare nel quaderno il produttore e la formulazione insieme al risultato.

L'agar EMB preparato e non inoculato ha in genere un colore che va dal rosso-bruno al viola rossastro, talvolta con una sfumatura verdastra o un precipitato fine. Questo colore di fondo non è crescita. Confrontare ogni lettura con una piastra non inoculata o con l'aspetto iniziale documentato e leggere la piastra primaria dopo circa 18–24 ore di incubazione aerobica a 35–37 C, salvo diversa indicazione del protocollo didattico. Un'incubazione prolungata può modificare l'aspetto associato alla fermentazione.

Come osservare la piastra

Usare due tipi di illuminazione. Per prima cosa esaminare la piastra in luce riflessa o obliqua e inclinarla: il riflesso metallico è iridescente e può comparire o scomparire a seconda dell'angolo di osservazione. Poi esaminarla in luce trasmessa per valutare il colore delle colonie e i centri scuri. Basarsi su colonie ben isolate, perché l'affollamento e le colonie vicine modificano l'accumulo locale di acido e possono attenuare o accentuare il colore. La raccolta di immagini ASM lo dimostra direttamente: E. coli in coltura mista può perdere il riflesso atteso perché i microrganismi circostanti alterano l'acidità locale.

Includere controlli ogni volta che l'esercitazione lo consente. Un insieme di controlli comunemente usato nella didattica comprende E. coli ATCC 25922 per il fenotipo blu-nero con riflesso metallico, un non fermentante come Salmonella Typhimurium ATCC 14028 o Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 per il fenotipo incolore e un Gram positivo come Enterococcus faecalis o Staphylococcus aureus come controllo di inibizione, secondo le tabelle standard di controllo qualità per i terreni EMB. Se il controllo positivo non presenta il riflesso, sospettare problemi di incubazione, affollamento o formulazione prima di mettere in dubbio il microrganismo sconosciuto.

Atlante illustrativo delle piastre

Le piastre riportate di seguito sono illustrazioni generate, non fotografie di colture reali. Mostrano l'aspetto da ricercare, non la tonalità esatta di un singolo ceppo. Confrontarle con le fotografie di riferimento ASM e con piastre reali del laboratorio didattico.

Piastra 1: Escherichia coli su agar EMB, fermentante vigoroso del lattosio

E. coli su agar EMB presenta tipicamente una colorazione dal viola scuro al blu-nero, spesso con un centro scuro e un riflesso verde metallico dovuto all'intensa produzione di acido. Il riflesso è il caratteristico reperto che gli studenti cercano, ma va considerato un elemento a sostegno dell'identificazione, non una definizione. La sua intensità varia in funzione del ceppo, del tempo di incubazione, della densità delle colonie e dell'angolo di osservazione. L'assenza del riflesso non esclude E. coli, e una colonia scura senza riflesso può indicare diversi altri fermentanti. Per qualsiasi analisi successiva, scegliere una colonia ben isolata anziché basarsi sulla lettura di un settore affollato.

Piastra 2: Klebsiella pneumoniae su agar EMB, fermentante mucoide

Klebsiella pneumoniae su agar EMB forma tipicamente colonie grandi, lucide e mucoidi, con tonalità dal rosa-viola al bruno-viola, spesso con centri scuri ma generalmente senza un forte riflesso metallico. Una morfologia simile si osserva in fermentanti affini come Enterobacter. La consistenza mucoide e le dimensioni della colonia fanno parte della lettura: una colonia rosa piccola e piatta ha un peso interpretativo diverso rispetto a una colonia grande, rilevata e mucoide. Come per E. coli, la piastra suggerisce un fenotipo di fermentazione, mentre l'identificazione a livello di specie richiede la conferma biochimica descritta più avanti.

Piastra 3: Salmonella su agar EMB e altri non fermentanti, colonie incolori

Salmonella su agar EMB e altri microrganismi che non fermentano il lattosio, tra cui Shigella e molti isolati di Pseudomonas, crescono tipicamente formando colonie da incolori a traslucide o ambrate pallide. Alcune formulazioni e condizioni producono una lieve sfumatura rosata, quindi una colonia rosa pallido non è automaticamente un fermentante. L'EMB non distingue Salmonella da Shigella o da altri non fermentanti; questa distinzione spetta ai test successivi. Va inoltre ricordato che sono stati documentati ceppi di Salmonella lattosio-positivi con colonie metalliche simili a quelle di E. coli: un motivo in più per cui una sola piastra non può chiudere il caso.

Piastra 4: Serratia marcescens e l'insidia della formulazione

Serratia marcescens merita una sezione dedicata perché gli studenti spesso si aspettano colonie rosse e finiscono per interpretare male la piastra. La maggior parte degli isolati clinici non fermenta il lattosio, quindi sull'EMB di Levine appare comunemente pallida o debolmente colorata. Poiché molti isolati fermentano il saccarosio, una formulazione che lo contiene può produrre una reazione più scura o più marcata in relazione alla produzione di acido. Non bisogna nemmeno aspettarsi il classico pigmento rosso prodigiosina a 35–37 C: la produzione del pigmento non è affidabile alla temperatura di incubazione. Quando un protocollo descrive Serratia marcescens su agar EMB, verificare a quale formulazione si riferisce. Una rassegna sul metabolismo di Serratia riassume il profilo lattosio-negativo e variabile per il saccarosio alla base di questa insidia.

Piastra 5: controlli e microrganismi inibiti

I microrganismi Gram positivi come Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus e Bacillus sono generalmente inibiti o fortemente limitati nella crescita su agar EMB, anche se l'inibizione non è assoluta per ogni ceppo. Un pannello di controlli rende la lettura attendibile: il controllo di E. coli dovrebbe mostrare una buona crescita con colore blu-nero e riflesso metallico, il controllo non fermentante dovrebbe mostrare una crescita incolore e il controllo di inibizione dovrebbe mostrare una crescita scarsa o assente. Se il controllo di inibizione cresce bene, la selettività non ha funzionato e ogni altra lettura su quel lotto è dubbia. I metodi di colorazione rispondono a una domanda diversa rispetto ai terreni di coltura; per la parte del laboratorio dedicata alla colorazione dei vetrini, vedere l'atlante della colorazione con blu di metilene.

Confronto e limiti interpretativi

Tre frasi riassumono gli aspetti ingannevoli. Scuro non significa E. coli, poiché Klebsiella, Enterobacter e altri fermentanti sviluppano centri scuri senza riflesso. Rosa non significa Klebsiella, poiché i fermentanti moderati o lenti e alcuni microrganismi nominalmente non fermentanti appaiono rosa o color lavanda. Il riflesso non identifica definitivamente E. coli, poiché altri fermentanti vigorosi possono produrlo. Il protocollo didattico e le sue immagini di colture miste illustrano ciascuno di questi limiti.

Limiti della conferma

L'agar EMB indica un fenotipo, non una specie. Microrganismi diversi possono condividere lo stesso aspetto delle colonie, e un microrganismo può discostarsi dall'immagine da manuale in funzione del ceppo, dell'età, dell'affollamento, della formulazione e dell'incubazione. Per questo i percorsi didattici e clinici considerano la morfologia su EMB un'indicazione presuntiva.

Una procedura corretta per lo studente è: descrivere la colonia isolata (dimensioni, colore, centro, riflesso in luce obliqua, carattere mucoide), annotare formulazione, tempo e temperatura di incubazione e controlli; quindi ottenere una coltura pura mediante subcoltura di una colonia ben isolata prima di qualsiasi test di conferma. Gli approfondimenti comuni comprendono la colorazione di Gram e le reazioni IMViC per l'identificazione presuntiva di E. coli e dei coliformi, TSI o KIA e pannelli biochimici specifici per i microrganismi enterici, con identificazione sierologica, MALDI TOF o altri metodi validati quando l'attività lo richiede. Per comprendere come l'EMB si inserisca tra i terreni selettivi e differenziali per i microrganismi enterici, consultare le introduzioni ai terreni di coltura enterici e gli approfondimenti sulla colorazione di Gram. Per la questione correlata di ciò che una colorazione blu del vetrino può o non può dimostrare, l'atlante della colorazione con blu di metilene mantiene separate osservazione e conclusione con lo stesso approccio.

Scrivere l'osservazione prima della conclusione. «Colonie blu-nere scure con riflesso verde dipendente dall'angolo di osservazione su EMB di Levine a 24 ore, compatibili con una vigorosa fermentazione del lattosio» è un'affermazione sostenibile. «E. coli, confermato» richiede il passaggio di conferma che la sola piastra non può fornire.