Chi ha sviluppato la colorazione viola del sangue? Malachowski, Romanowsky, Giemsa

L'eosina è rossa. Il blu di metilene è blu. Mescolando i due e applicando la miscela a uno striscio di sangue essiccato, alcune parti dello striscio diventano viola.

Non tutte. In un buon preparato, i nuclei dei globuli bianchi assumono un colore rosso-viola e, all'interno di un parassita della malaria, la cromatina assume lo stesso colore, mentre i globuli rossi circostanti restano rosa e il citoplasma resta grigio-blu. È il viola a permettere di distinguere i tipi cellulari.

Nessuno dei due flaconi contiene viola. Il colore compare solo quando un particolare prodotto di degradazione del blu di metilene incontra l'eosina sul vetrino, e negli anni 1880 e 1890 nessuno sapeva che quel prodotto esistesse, tantomeno che cosa fosse. Chi cercava di ottenere quel colore lavorava da solo, con coloranti impuri e senza un metodo affidabile per sapere che cosa contenesse un flacone dopo due mesi su uno scaffale.

Ecco perché la domanda del titolo ha più di una risposta sostenibile, e perché la risposta è cambiata nel 2011.

Un risultato che cambiava con la miscela

La colorazione non fu inventata. Si sviluppò per aggiunte successive. Ogni modifica alla miscela forniva esattamente una nuova informazione visibile, e la sequenza di queste informazioni è il modo più chiaro per leggerne la storia.

Anno	Che cosa conteneva il recipiente	Che cosa si poteva vedere
1865	Acido picrico, il primo colorante sintetico applicato al sangue, da Wilhelm Erb	Una trama simile a un merletto all'interno di alcuni globuli rossi.
1876	Blu di metilene, da Heinrich Caro e Adolf von Baeyer alla BASF	Bacilli tubercolari, nelle mani di Robert Koch. Cellule del sangue in un'unica tonalità di blu.
1880	Blu di metilene più fucsina acida, la colorazione neutra di Ehrlich	Globuli rossi e granuli degli eosinofili rossi, nuclei blu intenso, citoplasma dei linfociti azzurro e granuli viola scuro che assorbivano entrambi i coloranti. Ecco perché la cellula si chiama neutrofilo. La prima conta differenziale dei globuli bianchi.
1888	Blu di metilene più eosina. Czesław Chęciński	Il parassita stesso: forme blu a margherita (Plasmodium malariae) e forme a falce (gametociti di P. falciparum). Non il suo nucleo.
1890	Più blu di metilene, meno alcol, più idrossido di potassio. Albert Plehn	Una gamma cromatica più ampia e intensa, con globuli rossi e granuli degli eosinofili color rosa. Ancora soltanto rosso e blu.
1890	Eosina più blu di metilene reso alcalino con borace. Ernst Malachowski	Cromatina rosso-viola all'interno del parassita, con il nucleo distinguibile dal citoplasma. Un risultato intenzionale e, secondo il suo resoconto, riproducibile.
1891	Eosina più blu di metilene da un flacone con muffa, vecchio di oltre due mesi. Dmitri Romanowsky	Lo stesso viola, una sola volta, con un metodo che altri non riuscivano a riprodurre.
1898 a 1902	Colorante policromo estratto con cloroformio (Nocht); metanolo (Jenner); ridissoluzione del precipitato in alcol (Leishman, Reuter, Wright); quantità misurate di coloranti con glicerolo (Giemsa)	Il viola ottenibile a richiesta, in un prodotto che si comportava allo stesso modo anche nel laboratorio successivo. La versione di Jenner, senza colorante policromato, non produceva viola.
1940 a 1943	Lillie, Roe e Wilcox separarono i componenti e li provarono uno alla volta	Azure B, non la miscela, è il componente che produce il viola.

È l'andamento dell'ultima colonna a contare. Ogni progresso ampliava la gamma cromatica, e ogni ampliamento rendeva visibile un'altra struttura. Il viola non è un abbellimento della tecnica: è la differenza tra vedere che un parassita è presente e vedere di che cosa è fatto. Il percorso del colorante da uno stabilimento BASF alla medicina è una storia più lunga, con una documentazione propria. L'intera sequenza riportata sopra, con la fonte di ogni voce, è conservata in una cronologia dei contributi con collegamenti alle fonti.

Figura: le stesse sei miscele rappresentate attraverso ciò che conteneva il recipiente e ciò che ne risultava. I cerchi mostrano i coloranti; i blocchi sottostanti mostrano i colori che quei coloranti potevano produrre in uno striscio di sangue. Prima del 1890 non compare alcun blocco rosso-viola, e dopo quella data non manca mai.

L'uomo che usò il borace intenzionalmente

Ernst Malachowski era un medico di Breslavia, oggi Wrocław, che trascorse la carriera nell'attività privata e in una piccola clinica gestita insieme a un collega, svolgendo il lavoro di laboratorio nel tempo libero. Nacque a Strzelno il 12 marzo 1857, studiò medicina all'Università di Breslavia e dal 1882 al 1887 lavorò come assistente in medicina interna all'Ospedale di Tutti i Santi, allora il secondo ospedale più grande della Germania.

Cominciò nel 1888 con la doppia colorazione di Chęciński e Plehn. In un preparato realizzato nel 1889 vide che la cromatina del nucleo del plasmodio si colorava diversamente dal citoplasma, ma poi scoprì di non riuscire a riprodurre il risultato. Provò ad acidificare il blu di metilene, peggiorando le cose. Provò ad alcalinizzarlo con il borace, e funzionò ogni volta. Dimostrò pubblicamente il metodo il 15 giugno 1890 e ne pubblicò una descrizione più completa nell'agosto 1891, includendo l'istruzione relativa al borace. Segnalò che la colorazione richiedeva ventiquattro ore e che i risultati erano facilmente riproducibili.

Ventiquattro ore sono molte in un laboratorio diagnostico, e il suo articolo non si soffermava sul colore viola-rosso del nucleo del parassita. Qualunque fosse il motivo, nessuno riprese l'alcalinizzazione intenzionale del blu di metilene finché Nocht non la eseguì di nuovo nel 1898. Malachowski non scrisse mai più sulla colorazione del sangue.

La ragione per cui fino a poco tempo fa si sapeva così poco di lui riguarda gli archivi, non un mistero. Nella letteratura medica non sopravvisse quasi nessuna traccia della sua vita, e ciò che rimase arrivò attraverso un'unica via. Sua figlia Marie lasciò la Germania per Londra nel 1939, prestò servizio nell'esercito britannico e si stabilì in Canada; la sua raccolta di documenti familiari finì al Leo Baeck Institute di New York. Suo fratello Leo fu ucciso nella Prima guerra mondiale. Sua sorella Eva fu deportata da Breslavia al campo di transito di Izbica nell'aprile 1942 e non tornò mai. Sua madre Hedwig si tolse la vita il 22 aprile 1942, piuttosto che attendere la stessa deportazione. Malachowski era morto nel 1934, prima di tutto questo.

Una storia familiare che finisce così è una storia familiare che smette di essere citata. I due articoli che ricollocarono Malachowski nello sviluppo della colorazione, entrambi pubblicati nel 2011, furono ricostruiti a partire da documenti d'archivio a Poznań e Wrocław e dalle carte di Marie a New York.

Un flacone con muffa e un russo fortunato

Dmitri Romanowsky studiò medicina all'Accademia medico-militare di San Pietroburgo e si occupò di malaria per gran parte della carriera. Nel 1890 pubblicò un metodo che, sulla carta, era quasi identico a quello di Chęciński: blu di metilene non modificato ed eosina, con un po' più di eosina.

Nel settembre 1891 pubblicò il metodo che lo rese celebre, e il dettaglio decisivo era nascosto nelle istruzioni. I risultati migliori venivano dalla soluzione madre di blu di metilene, una soluzione rimasta a riposo per oltre due mesi e sulla quale era cresciuta della muffa. La muffa e il tempo di riposo avevano parzialmente demetilato il colorante. Romanowsky non lo sapeva e non poteva controllare il processo, e gli altri ricercatori che provarono il suo metodo non riuscirono a ottenere il viola. La sua tesi era stata presentata a San Pietroburgo nel giugno 1891, ed è per questo che il resoconto tradizionale considera il 1891 l'anno della scoperta.

La dimostrazione di Malachowski si era svolta nel giugno 1890, oltre un anno prima, e il suo metodo funzionava intenzionalmente.

Perché l'eponimo andò all'uomo sbagliato

Le argomentazioni a favore di Malachowski furono raccolte da Kristine Krafts, Ernst Hempelmann e Barbara Oleksyn, e poggiano su quattro elementi. La data della dimostrazione pubblica: giugno 1890 contro settembre 1891. La parola intenzionale contrapposta alla parola fortuito. Il fatto che Malachowski avesse pubblicato il proprio metodo, borace compreso, mentre quello di Romanowsky dipendeva da una variabile non controllata. E l'osservazione che la descrizione del nucleo del plasmodio, insieme al viola che lo rendeva visibile, era di fatto scomparsa dalla letteratura per sette anni, perché nessuno riusciva a riprodurre la versione accidentale.

La loro conclusione è netta. Nell'articolo biografico definiscono l'attribuzione «una farsa», e citano Ralph Lillie, che nel 1978 scrisse: «forse dovremmo chiamare questa famiglia di colorazioni colorazioni di Malachowski».

La rivendicazione è contestata, come accade di solito con le rivendicazioni di priorità, e vale la pena spiegare i termini della controversia anziché risolverla. Una discussione sulla priorità deve precisare in che cosa consistesse la scoperta. Se la scoperta è il colore viola, Malachowski ha la dimostrazione documentata più antica. Se la scoperta è il metodo pubblicato, entrambi pubblicarono nel 1891 e l'eponimo andò a Romanowsky. Se la scoperta è la spiegazione, nessuno dei due può rivendicarla, perché nessuno sapeva che la maturazione fosse una demetilazione e nessuno sapeva dire perché comparisse quel colore. Quest'ultimo punto è quello che i resoconti divulgativi tralasciano. Il componente attivo era un'impurità che nessuno aveva identificato, e la prima persona a produrre intenzionalmente il colore lo fece seguendo una ricetta empirica riproducibile, non comprendendo che cosa facesse quella ricetta.

I due articoli del 2011 sono l'esposizione pubblicata più completa delle argomentazioni a favore di Malachowski, ed entrambi sono consultabili gratuitamente su PubMed: l'ampia rassegna a PMID 21235291 e l'articolo biografico a PMID 21660627. La scheda PubMed della rassegna riporta anche un commento all'articolo, pubblicato sulla stessa rivista più tardi nello stesso anno a 86(5):366, un opportuno richiamo al fatto che l'argomentazione fu contestata sulla stampa scientifica non appena apparve.

La disputa non riguarda la chimica. Tutti concordano su che cosa sia il viola e su quali componenti lo producano. Il disaccordo riguarda chi ci sia arrivato per primo e se un risultato accidentale che nessuno riusciva a ripetere possa contare davvero come un traguardo raggiunto.

Che cosa apportarono i nomi successivi

Se Malachowski produsse il viola per primo, perché la colorazione porta i nomi di Romanowsky, Wright e Giemsa?

Perché una colorazione che funziona una sola volta nelle mani del suo inventore non è un reagente. Il lavoro successivo trasformò una miscela capricciosa in qualcosa che un tecnico in un altro paese poteva usare un martedì qualunque.

Nocht ci arrivò con il ragionamento. Dopo non essere riuscito a ottenere un risultato affidabile da un semplice colorante neutro, concluse che il viola dovesse derivare da qualcosa presente nel blu di metilene che non era blu di metilene, e si mise a cercarlo. Unna aveva già notato che le soluzioni invecchiate di blu di metilene coloravano di rosso i granuli dei mastociti, e aveva proposto che durante la maturazione del colorante si formasse una nuova sostanza. Bernthsen aveva dimostrato nel 1885 che le condizioni alcaline rimuovono gruppi metilici dal blu di metilene, e che questi prodotti sono quelli che oggi chiamiamo azzurri. Nocht estrasse la frazione attiva con cloroformio e poté chiamarla soltanto rosso dal blu di metilene; Michaelis la chiamò azzurro I nel 1901. Jenner risolse la logistica. Ridissolvendo il precipitato di blu di metilene ed eosina in metanolo assoluto si otteneva un'unica soluzione stabile, che fissava lo striscio mentre lo colorava ed eliminava la fissazione a caldo. Leishman e Reuter combinarono un colorante policromato con un solvente alcolico, ottenendo insieme stabilità e viola. Wright sostituì un'incubazione di dodici ore a 65 °C e dieci giorni di riposo con un'ora in corrente di vapore. Giemsa smise del tutto di affidarsi a una soluzione maturata casualmente, usando quantità misurate di coloranti noti con glicerolo nel metanolo, così che il prodotto resistesse al caldo tropicale. Non pubblicò mai il modo in cui produceva l'azzurro di metilene puro. Lo vendette al laboratorio del dottor Grübler a Lipsia, che lo commercializzò come azzurro I e sosteneva che soltanto la propria versione fosse l'autentico colorante di Giemsa.

L'identità di quell'azzurro è ancora oggetto di discussione. Alcuni sostengono che fosse semplicemente blu di metilene policromato, altri che fosse ricco di Azure B. La risposta emerse da una guerra. Quando i coloranti tedeschi divennero irreperibili, un gruppo del Servizio di sanità pubblica degli Stati Uniti, composto da Ralph Lillie, Maurice Roe e Aimee Wilcox, scoprì che la colorazione migliore si otteneva da tre componenti separati: blu di metilene non modificato, il suo prodotto di degradazione demetilato Azure B ed eosina. Azure B sostituì l'azzurro I non più disponibile, e quei tre componenti sono ancora la base della colorazione usata oggi per diagnosticare la malaria.

La chimica dell'interazione di questi tre componenti sul vetrino è una questione a parte, trattata in un'altra pagina. La pagina sui ruoli dei coloranti e sulla chimica delle colorazioni di tipo Romanowsky spiega che cosa fanno rispettivamente Azure B ed eosina e perché la coppia produce un colore che nessuno dei due produce da solo. La pagina dedicata alla microscopia e alle applicazioni di laboratorio tratta invece il lato pratico: che cosa mostra un dato preparato e come valutare se un determinato prodotto sia adatto al metodo che si intende usare.

La parte della storia che è ancora attuale

Un dettaglio di questa storia non smise di essere vero nel 1902. Per circa cinquant'anni, il componente più importante della colorazione standard per la malaria usata nel mondo fu un'impurità senza nome. Era presente per caso, la sua quantità variava da un flacone all'altro, la sua identità rimase un segreto commerciale per parte di quel periodo e la sua proporzione fu oggetto di discussione fino agli anni 1940. Chi usava la colorazione non era negligente. Non aveva modo di sapere che cosa contenesse il flacone.

La versione moderna dello stesso problema è una specifica che descrive soltanto una parte del materiale. La conformità USP è la via per ottenere la massima purezza offerta dal mercato, perché si tratta di uno standard pubblicato completo, non di una singola misurazione: identità, purezza, impurità organiche inclusi i coloranti azzurri, solventi residui, impurità elementari, residuo alla calcinazione, limiti microbici ed endotossine batteriche. Blupreme si procura il blu di metilene da un produttore farmaceutico e pubblica il certificato di analisi completo, così che ogni voce di quell'elenco possa essere verificata anziché semplicemente dichiarata. Un certificato che riporta un risultato sui metalli pesanti e lo chiama conformità USP è l'equivalente odierno di un flacone etichettato «blu di metilene maturato»: forse un ottimo reagente, ma l'etichetta non dice che cosa contenga.