Blu di metilene e SLA: perché i risultati differiscono tra i modelli sperimentali

Cercando informazioni sul blu di metilene e la SLA, si trovano due affermazioni che sembrano contraddirsi. Una sostiene che il colorante blu abbia protetto i neuroni nei modelli di SLA. L'altra sostiene che non abbia avuto alcun effetto in un topo con SLA. Entrambe citano studi reali ed entrambi gli studi meritano di essere presi sul serio. La contraddizione scompare quando si esplicita il concetto alla base di ciascun esperimento: il modello definisce la portata dell'affermazione.

Un risultato in un verme è un'affermazione che riguarda un verme. Un risultato in una larva di pesce è un'affermazione che riguarda una larva di pesce. Nessuno dei due riguarda un paziente finché il decorso della malattia in un mammifero non lo conferma. Questo articolo confronta i due studi più citati per chiarire perché le loro risposte differiscono.

I due esperimenti in una tabella

Tieni aperta questa tabella durante la lettura. Contiene tutte le differenze importanti tra gli studi.

La genetica differisce, le specie differiscono, la via di somministrazione differisce, i tempi differiscono e gli endpoint differiscono. Il genotipo è solo una delle cinque differenze, quindi il confronto non può dimostrare che il blu di metilene agisca selettivamente su una via biologica della SLA. Dimostra qualcosa di più circoscritto, ma comunque utile: il marcato recupero ottenuto con un'esposizione diretta e precoce in modelli semplici non si è riprodotto durante il decorso della malattia in un mammifero con somministrazione orale cronica.

Il risultato positivo: cosa ha mostrato lo studio su vermi e pesci

Lo studio del 2012 su vermi e pesci ha fatto esprimere TDP-43 o FUS umane mutate nei motoneuroni dei vermi e ha iniettato mRNA umano mutato negli embrioni di pesce. Si tratta di modelli di proteotossicità. Riproducono gli effetti tossici della proteina mutata sul movimento e sulla morfologia neuronale nell'arco di giorni, non l'intero decorso della SLA umana nell'adulto nell'arco di anni.

Il trattamento è iniziato molto precocemente. I vermi sono cresciuti su agar contenente blu di metilene fin dalla schiusa. Gli embrioni di pesce sono rimasti nella soluzione del farmaco per una notte, a partire da 24 ore dopo la fecondazione, e il comportamento è stato valutato circa due giorni dopo. Tra il farmaco e il neurone non si frapponeva una barriera ematoencefalica come avviene in un mammifero, e non sono stati misurati i livelli del farmaco nel plasma o nel cervello.

In quelle condizioni, gli effetti erano marcati e coerenti. Sia 6 sia 60 μM hanno ridotto la paralisi dipendente dall'età nei vermi con TDP-43 e FUS. Al giorno 12 della fase adulta, circa l'80 per cento dei vermi con TDP-43 non trattati era paralizzato, contro circa il 10 per cento dei vermi trattati dalla schiusa. Un saggio sinaptico indicava la stessa direzione: i vermi con TDP-43 erano ipersensibili all'aldicarb, un farmaco usato per valutare la trasmissione neuromuscolare, e il blu di metilene ha riportato la risposta verso la normalità. Il numero di prolungamenti dei motoneuroni in degenerazione è diminuito, con l'effetto più evidente a 60 μM. Nei pesci, il nuoto evocato dal contatto è migliorato notevolmente e gli assoni motori accorciati si sono allungati nuovamente verso la lunghezza normale a 30 o 60 μM, sebbene il recupero fosse parziale anziché completo.

I dati sullo stress ossidativo sono compatibili con un'interpretazione antiossidante. I vermi e i pesci mutanti mostravano valori elevati degli indicatori di specie reattive dell'ossigeno, che diminuivano con il trattamento, e i vermi normali esposti al blu di metilene sopravvivevano a una sollecitazione pro-ossidante molto più a lungo dei vermi non trattati. Contano però due limiti. I livelli totali delle proteine mutate TDP-43 e FUS non sono diminuiti e lo studio non ha quantificato direttamente gli aggregati proteici: mostra quindi un recupero funzionale senza dimostrare l'eliminazione degli aggregati. Chi segue il modo in cui vengono solitamente formulate le ipotesi redox e mitocondriali dovrebbe considerare il meccanismo sostenuto dai dati, ma non definitivamente chiarito.

La tempistica era il dettaglio più istruttivo. Quando gli autori hanno atteso il giorno 5 della fase adulta per iniziare il trattamento, il tasso di paralisi al giorno 12 era di circa il 55 per cento, anziché circa il 10 per cento osservato con il trattamento dalla schiusa. Stesso farmaco, stesso verme, stessa mutazione, effetto molto più piccolo. Gran parte del beneficio apparente dipendeva dall'esposizione profilattica precoce.

Il risultato nullo: cosa ha mostrato lo studio sui topi con SOD1

Lo studio del 2011 sui topi ha affrontato una domanda più difficile in un sistema più rigoroso. Nei topi congenici con SOD1 G93A, la malattia progredisce dal tremore degli arti posteriori alle alterazioni dell'andatura e alla perdita del riflesso di raddrizzamento, fino a un endpoint terminale predefinito. Il trattamento è iniziato prima dei sintomi, al giorno 45, ed è proseguito quotidianamente, mentre gli osservatori valutavano lo stato neurologico su una scala da 0 a 6. È un esperimento sull'intero decorso della malattia, quindi più vicino a ciò che interesserebbe a un paziente rispetto a qualsiasi curva di paralisi in un verme.

I risultati principali erano nulli. L'esordio complessivo si è verificato a 121 giorni nei controlli, contro 124 giorni con il blu di metilene, una differenza non significativa. La sopravvivenza fino allo stadio terminale era di 167 giorni contro 170 giorni, anch'essa non significativa. Alcune analisi secondarie favorivano il trattamento: le femmine mostravano un ritardo nell'esordio di circa 7 giorni e gli animali trattati trascorrevano un po' più tempo negli stadi lievi e meno in quelli gravi. Con sottogruppi per sesso piccoli e numerosi confronti tra stadi, queste analisi vanno interpretate come spunti per formulare ipotesi, non come prove. Non sono stati effettuati conteggi neuronali, saggi di aggregazione di SOD1 o misurazioni di marcatori ossidativi o infiammatori, quindi lo studio non può nemmeno dire se il farmaco abbia raggiunto i propri bersagli senza produrre effetti oppure se, a questa dose, non abbia mai agito su di essi. È stata testata una sola dose.

Gli stessi autori hanno evidenziato il limite più profondo, che vale in entrambe le direzioni. Il modello con un numero elevato di copie di SOD1 G93A riproduce bene la malattia dovuta alla tossicità di SOD1, ma la malattia legata a SOD1 rappresenta una piccola parte della SLA familiare e ha una biologia diversa da quella della maggior parte dei casi sporadici. Hanno suggerito di testare nuovamente i composti candidati in modelli di mammifero basati su TDP-43. Da allora, questa proposta è diventata più complessa, perché gli autori dello studio su vermi e pesci osservano che anche un altro studio sul blu di metilene in topi con TDP-43 non ha migliorato gli esiti motori. Un composto può quindi apparire molto efficace in un sistema con TDP-43 e privo di effetti in un altro sistema con TDP-43. Il sistema conta quanto il gene.

Perché un miglioramento in un verme o in un pesce non può dimostrare un beneficio nei pazienti

Considera ogni modello come una risposta a una domanda diversa.

Primo, la biologia differisce. TDP-43 e FUS sono proteine che legano gli acidi nucleici e condividono interazioni genetiche in questi sistemi semplici, mentre la tossicità di SOD1 si sviluppa attraverso meccanismi prossimali in parte distinti. Un farmaco che attenua uno stress proteotossico non deve necessariamente attenuare l'altro, e il successo contro la sovraespressione embrionale non deve necessariamente prevedere il successo contro una neurodegenerazione lenta nell'adulto, con infiammazione, coinvolgimento gliale e deterioramento sistemico.

Secondo, l'esposizione differisce. Un'esposizione continua per immersione a concentrazioni micromolari non equivale alla somministrazione orale. Assorbimento intestinale, metabolismo di primo passaggio, legame alle proteine plasmatiche, penetrazione nel cervello ed eliminazione si frappongono tutti tra una dose ingerita e un motoneurone spinale. Nessuno dei due studi ha misurato i livelli del farmaco nel sistema nervoso, quindi nessuno può mettere in relazione le proprie concentrazioni con quelle dell'altro.

Terzo, la tempistica differisce. I benefici nei vermi e nei pesci dipendevano fortemente dal trattamento prima che si accumulassero alterazioni patologiche. Anche il trattamento nei topi è iniziato prima dei sintomi, il che è un punto di forza; tuttavia, nell'essere umano il trattamento inizierebbe quasi sempre dopo l'esordio dei sintomi, quindi ancora più tardi. Un segnale profilattico in un saggio su embrioni di due giorni è un punto di partenza per la ricerca, non un modello di uso clinico.

Quarto, gli endpoint differiscono. La paralisi a 12 giorni, la sensibilità all'aldicarb, la lunghezza degli assoni in micrometri e la distanza percorsa nuotando sono fenotipi prossimali. L'esordio e la sopravvivenza in un mammifero integrano tutti i processi compensatori e tutte le complicazioni dell'organismo. È frequente che i farmaci modifichino gli indicatori prossimali senza modificare la sopravvivenza: è per questo che esistono gli endpoint relativi al tempo fino a un evento nei mammiferi.

Chi desidera una lista di controllo per valutare la prossima notizia può ricavarla da come leggere gli studi preclinici: chiedersi quali siano la specie, il transgene, la dose e la via di somministrazione; se siano stati misurati i livelli del farmaco; quando sia iniziato il trattamento rispetto allo sviluppo delle alterazioni patologiche; se l'endpoint fosse un fenotipo a breve termine o il decorso della malattia; e se l'effetto sia stato replicato in un secondo laboratorio. Il quadro più ampio delle evidenze sul blu di metilene nell'essere umano resta il riferimento per verificare se qualcuno di questi segnali iniziali si sia poi tradotto in dati clinici.

Cosa significa per i pazienti e le famiglie

Da questi studi non deriva alcun protocollo consolidato di blu di metilene per la SLA. Lo studio positivo sostiene ulteriori ricerche sui meccanismi ossidativi e sinaptici nella biologia di TDP-43 e FUS. Lo studio con risultato nullo depone contro l'aspettativa di modificare il decorso della malattia con una somministrazione orale cronica a questa esposizione nella malattia di tipo SOD1. Insieme descrivono risultati discordanti tra modelli, non una raccomandazione terapeutica.

La sicurezza merita lo stesso approccio prudente dell'efficacia. Gli studi sulla SLA nei topi non dicono nulla sulle dosi sicure nell'essere umano, e il blu di metilene comporta rischi reali di emolisi in caso di deficit di G6PD e di tossicità serotoninergica quando viene associato a farmaci serotoninergici. Un sospetto deficit di G6PD, l'uso attuale di antidepressivi e qualsiasi modifica programmata della terapia devono essere discussi con un medico, così come vanno esaminati i dati generali sulla sicurezza del blu di metilene prima di agire sulla base di notizie riguardanti risultati di laboratorio.

La conclusione si riassume in una frase. Il blu di metilene ha prodotto un marcato recupero dei fenotipi nei vermi e nelle larve di pesce con TDP-43 e FUS in condizioni di esposizione precoce, ma sostanzialmente nessun beneficio sull'esordio o sulla sopravvivenza in uno studio su topi con SOD1 e somministrazione orale cronica; l'interpretazione corretta è quindi quella di evidenze dipendenti dal modello, che non sostengono l'uso nei pazienti.