Il blu di metilene nella ricerca sullo zebrafish: additivo per l'allevamento e fattore confondente sperimentale

L'acqua per le uova di zebrafish è spesso leggermente azzurra, e quasi nessuno annota il motivo. Il colorante è il blu di metilene, aggiunto contro i funghi, e la maggior parte dei protocolli lo considera un elemento di fondo. Qui, però, il concetto di fondo è sbagliato. È più corretto parlare di un fattore sperimentale non dichiarato: qualcosa presente nelle piastre trattate e assente nei controlli, farmacologicamente attivo alle concentrazioni utilizzate e capace di modificare proprio gli endpoint misurati dall'esperimento.

Questa distinzione guida tutto ciò che segue. L'uso abituale di un antifungino nell'allevamento è una questione. La neutralità dell'additivo rispetto al proprio saggio è un'altra. La letteratura recente sullo zebrafish risponde alla prima in modo rassicurante e alla seconda in modo meno confortante.

Che cosa prescrivono davvero le linee guida

Non esiste uno standard unico, e questo è parte del problema. Le indicazioni del Canadian Council on Animal Care consentono 0.5 mg/L, ovvero 0.00005%, nella soluzione di trasporto di uova e larve per ridurre la crescita fungina. Le linee guida europee sugli animali da laboratorio descrivono embrioni mantenuti in un mezzo che spesso contiene lo stesso 0.00005%. La ricetta E3 di Cold Spring Harbor specifica il doppio, 1 mg/L o 0.0001%, come ingrediente della formulazione. A queste indicazioni si contrappone un'omissione evidente: la linea guida OECD per il test di tossicità sugli embrioni di pesce specifica acqua di diluizione ricostituita e sostanza chimica in esame, senza alcuna raccomandazione sul blu di metilene né nella versione del 2013 né nella revisione successiva. Così, un laboratorio alleva embrioni di zebrafish in acqua azzurra contenente blu di metilene fin dalle prime ore di vita, un altro esegue il saggio regolatorio sugli embrioni in acqua incolore, ed entrambi definiscono normale il proprio mezzo. Chiunque confronti risultati tra laboratori o riunisca controlli storici eredita questa incoerenza.

Per inquadrare le concentrazioni, 0.00005% corrisponde a circa 1.56 micromolare e 0.0001% a circa 3.13 micromolare. Sono valori bassi, ed è allettante considerarli troppo bassi per avere importanza. Gli studi descritti di seguito verificano proprio questa ipotesi, esattamente a quelle concentrazioni.

Chi proviene dall'acquariofilia anziché dal laboratorio incontra la stessa molecola in un contesto diverso, trattato nella guida al blu di metilene per l'acquario. La chimica è la stessa; la spiegazione di come il colorante trasferisce elettroni attraverso le cellule chiarisce perché un composto attivo nelle reazioni redox ricorra negli studi sul metabolismo. Quanto segue riguarda specificamente l'acqua per le uova di zebrafish contenente blu di metilene.

Metabolismo: l'effetto cambia segno con lo stadio

Lo studio più informativo ha esposto zebrafish con sviluppo normale dal primo giorno di vita fino a 5 giorni dopo la fecondazione, misurando il metabolismo ossidativo a ogni stadio, come descritto nel resoconto pubblicato degli esperimenti sul metabolismo embrionale. Vale la pena descrivere con attenzione l'andamento, perché la direzione si inverte.

A 1 giorno dopo la fecondazione, il consumo basale di ossigeno aumentava negli embrioni esposti a entrambe le concentrazioni usate nell'allevamento. A 2 giorni, il potenziale di membrana mitocondriale nello strato superficiale delle larve risultava elevato con esposizioni a 0.00005%, 0.0001% e 0.0003%. Tra 4 e 5 giorni, dopo la schiusa, il segno si era invertito: il dispendio energetico ossidativo diminuiva, sia con un'esposizione continua dalla fecondazione sia con un'esposizione acuta limitata al periodo dal giorno 3 al giorno 4. Parallelamente, i trascritti delle subunità dei complessi respiratori mitocondriali diminuivano sia a 1 sia a 4 giorni, insieme ai trascritti associati alla steroidogenesi e alla gluconeogenesi.

Altre due osservazioni rendono il quadro più preciso. Alla concentrazione più alta usata nell'allevamento, la schiusa era leggermente anticipata: gli embrioni esposti erano più avanti a 2 giorni, mentre i controlli li raggiungevano entro il giorno 3. Inoltre, l'asse dello stress sembrava intatto: quando le larve di 5 giorni venivano sottoposte a uno stimolo stressante mediante agitazione vorticosa, il cortisolo dell'intero organismo aumentava normalmente in entrambi i gruppi. Il colorante, quindi, non è un tossico generalizzato per lo sviluppo a queste dosi e non attenua ogni risposta fisiologica. Modifica il metabolismo energetico in modo dipendente dallo stadio, aumentandolo prima della schiusa e riducendolo dopo.

Comportamento: perché due studi discordano e perché entrambi possono avere ragione

La letteratura sul comportamento sembra contraddittoria finché non si confrontano i disegni di esposizione. Uno studio sulla sicurezza rispetto allo sviluppo e al comportamento ha esposto gli embrioni a partire da circa 6 ore dopo la fecondazione a concentrazioni fino a 10 micromolare, rinnovando le soluzioni ogni giorno fino al giorno 4, per poi trasferire le larve in un mezzo privo di colorante nei giorni 5 e 6 e verificarne la locomozione con un saggio luce-buio al giorno 6. Risultato: nessun effetto significativo su mortalità, schiusa o morfologia, e nessun effetto del trattamento sulla locomozione. Gli autori hanno ragionevolmente raccomandato 10 micromolare come limite superiore nelle loro condizioni.

Un secondo gruppo, con alcuni autori in comune con lo studio sul metabolismo, ha impostato l'esposizione secondo la pratica effettiva dell'allevamento: colorante presente a partire da 2–3 ore dopo la fecondazione, con rinnovo parziale giornaliero, e comportamento misurato durante l'esposizione o poco dopo. Alle stesse concentrazioni abituali, le larve mostravano una riduzione della locomozione in un saggio di 24 ore, replicabile in diversi ceppi e laboratori, e lo studio sul confondimento comportamentale ha ricondotto l'effetto al tono serotoninergico, coerentemente con la nota inibizione della monoamino ossidasi da parte del colorante. L'osservazione più significativa è che il mezzo embrionale contenente blu di metilene mascherava la risposta locomotoria attesa all'SSRI fluoxetina. Un saggio di screening eseguito in acqua azzurra può quindi non rilevare un effetto farmacologico che l'acqua incolore renderebbe evidente.

Non c'è una vera contraddizione. Un composto può non lasciare alcun effetto residuo rilevabile due giorni dopo la rimozione in un saggio, ed essere comunque attivo mentre è presente in un altro. In pratica, il risultato nullo giustifica un limite superiore di concentrazione, non un'affermazione di neutralità, mentre il risultato positivo descrive il rischio rilevante: l'esposizione attiva durante la finestra di misurazione, nella configurazione esatta usata dalla maggior parte dei laboratori.

Un colorante redox dentro un saggio redox

Un'altra insidia merita un paragrafo a sé, perché altera lo strumento di misurazione anziché l'animale. Il saggio Alamar Blue per il dispendio energetico si basa esso stesso sulla chimica redox: la resazurina viene ridotta a resorufina fluorescente. Anche il blu di metilene partecipa alla chimica redox. Nei controlli privi di cellule, entrambe le concentrazioni usate nell'allevamento riducevano leggermente, ma in modo significativo, la fluorescenza di Alamar Blue dopo 24 ore. Negli esperimenti sugli animali, gli embrioni esposti venivano lavati almeno tre volte in un mezzo privo di colorante prima del saggio, e l'effetto biologico nelle larve già schiuse superava l'interferenza osservata in assenza di cellule. Sono quindi vere entrambe le cose: gli animali lavati mantengono un effetto metabolico reale, mentre il colorante non rimosso aggiunge un artefatto chimico diretto. I controlli devono separare i due fenomeni, altrimenti nessuno dei due valori ha significato. Le indicazioni generali sull'interpretazione dei risultati dei saggi basati sui coloranti si applicano qui con particolare forza.

Cronologia degli stadi di sviluppo

Il contenuto originale di questo articolo. Salvo diversa indicazione, le concentrazioni sono i due valori standard usati nell'allevamento, 0.00005% e 0.0001%.

L'andamento da ricordare è un aumento iniziale e una successiva diminuzione degli endpoint metabolici, con effetti comportamentali presenti durante l'esposizione e non rilevabili dopo la depurazione nell'unico saggio che l'ha verificato.

Lista di controllo per la progettazione dei controlli

Il secondo contenuto originale. Usatelo quando i protocolli per lo zebrafish con blu di metilene si intrecciano con un esperimento.

1. Riportate il colorante come reagente, non come acqua. Indicate la concentrazione sia in percentuale sia in micromolare, l'inizio e la fine dell'esposizione in ore o giorni dopo la fecondazione, il programma di rinnovo e l'intervallo senza colorante prima di ciascuna misurazione.
2. Adeguate i controlli alla domanda. Uno studio sulla sostanza chimica in esame richiede controlli privi di colorante; uno studio sulle pratiche di allevamento richiede gruppi senza e con colorante, registrando l'esito antifungino, poiché nessuno dei due studi citati ha misurato l'efficacia antifungina.
3. Lavate prima dei saggi redox, poi verificate. Risciacquate almeno tre volte in un mezzo privo di colorante ed eseguite in parallelo un controllo senza cellule con colorante e reagente, perché il colorante riduce direttamente il segnale di Alamar Blue.
4. Considerate ad alto rischio gli endpoint comportamentali e quelli relativi alle monoamine. Gli studi su locomozione, risposta di trasalimento, comportamenti di tipo ansioso, antidepressivi e inibitori della MAO dovrebbero evitare il colorante durante la misurazione oppure dimostrarne la neutralità per lo specifico endpoint; un intervallo senza colorante di uno o due giorni ha eliminato un effetto locomotorio, ma non è stato verificato per altri paradigmi.
5. Considerate ad alto rischio gli endpoint metabolici e mitocondriali a ogni stadio. Il consumo di ossigeno, il dispendio energetico, il potenziale di membrana e i trascritti della catena respiratoria cambiano alle concentrazioni usate nell'allevamento, in direzioni opposte prima e dopo la schiusa.
6. Non estendete la neutralità da un disegno sperimentale a un altro. Un risultato nullo dopo la rimozione del colorante non vale per un'esposizione in corso; un risultato morfologico nullo non vale per il metabolismo o l'interazione con un farmaco; un risultato ottenuto con un ceppo, una temperatura o una durata del saggio non vale per gli altri.
7. Dichiarate la linea guida seguita e la sua alternativa. Indicate esplicitamente le concentrazioni CCAC, europee o di Cold Spring Harbor e segnalate dove il test OECD sugli embrioni omette il colorante, così che il lettore possa collocare i vostri animali nel contesto.

Nulla di tutto questo è un argomento contro l'uso del colorante per mantenere vive le uova. È un argomento contro il lasciare che una scelta di allevamento entri nei dati senza essere esaminata. Il blu nella piastra è una molecola con proprietà farmacologiche, e gli esperimenti più esposti a distorsioni sono proprio gli screening metabolici e neurocomportamentali ad alta capacità per i quali oggi si preferiscono gli zebrafish giovani. Annotatene l'uso, controllatene gli effetti, eliminatelo prima di misurare e verificate il saggio a cui potrebbe partecipare senza dare nell'occhio.